Урология №3 / 2019
Частота выявления делеций AZF, мутаций CFTR и длинных аллелей CAG-повтора AR при первичной лабораторной диагностике в гетерогенной группе пациентов с мужским бесплодием
1 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Россия; 2 Научно-исследовательский институт урологии и интервенционной радиологии им. Н. А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, Москва, Россия; 3 ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», Москва, Россия
Введение. В качестве молекулярно-генетических причин бесплодия у мужчин диагностируют микроделеции в области AZF на Y-хромосоме, компаунд-гетерозиготы по тяжелой и мягкой мутациям CFTR, как маркеры предрасположенности – длинные аллели CAG-повтора гена андрогенового рецептора (AR). Зачастую проводят комплексную лабораторную диагностику, при которой одновременно определяют панель биохимических, иммунологических, цито- и молекулярно-генетических маркеров.
Целью настоящей работы стало выявление молекулярно-генетических нарушений, которые целесообразно одновременно тестировать у мужчины с неустановленной на текущий момент формой бесплодия для повышения информативности лабораторной диагностики.
Материалы и методы. Проведено ретроспективное исследование, в которое вошли 885 пациентов с мужским бесплодием. Делеции AZF определяли с помощью мультиплексной ПЦР по 10 STS-маркерам (sY83, sY84, sY86, sY127, sY134, sY143, sY152, sY157, sY254, sY255) и двум контрольным локусам, SRY и AMEL, с детекцией в полиакриламидном геле. Мутации в гене CFTR F508del, CFTRdel2,3(21kb), I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, W1282X, G542X, N1303K, R334W и 5Т выявляли методом ПЦР и мини-секвенирования. Для определения длины CAG-повтора AR проводили фрагментный анализ флуоресцентно меченных ПЦР-продуктов на капиллярном секвенаторе 3500xl.
Результаты. Делеции AZF выявлены в 8,2% случаев. Больше всего делеций было обнаружено в субрегионе AZFc – 58,9%, доля делеций AZFa составила 5,5%, AZFb – 12,3%, сочетанных делеций двух и трех субрегионов – 23,3%. Гетерозиготное носительство тяжелых мутаций CFTR обнаружено в 4,7% случаев, самой частой из них была мутация F508del – 83,3%, затем следовали CFTRdel21kb (7,1%) и W1282X (4,8%). Частота мягкой мутации сплайсинга 5Т составила 5,3%, а ее встречаемость достоверно превышала таковую в ранее опубликованной контрольной выборке (р=0,002). Генотипирование AR показало, что самым частым аллелем был 21(CAG), доля которого в распределении частот составила 21,5%. Выявлено 7 CAG-гетерозигот с синдромом Кляйнфельтера. Длинные аллели с 27 и более CAG-тринуклеотидами были определены в 7,5% случаев мужского бесплодия.
Заключение. В гетерогенной группе пациентов с мужским бесплодием при проведении первичной комплексной лабораторной диагностики причин заболевания целесообразно тестировать делеции AZF и наиболее частые мутации CFTR, включающие F508del, CFTRdel21kb, 1677delTA, 2143delT, W1282X и 5Т. Анализ более широкого перечня частых мутаций CFTR оправдан лишь в отношении пациентов с верифицированным обструктивным бесплодием. Перспективно секвенирование панелей ассоциированных с бесплодием генов с помощью NGS-технологий.
Введение. Частоту бесплодных браков в России и других развитых странах оценивают в пределах 11–20%, из них до 45% случаев связано с бесплодием у мужчин, представляя собой актуальную проблему в современной андрологии и урологии [1]. При диагностике мужского бесплодия поэтапно исключают наиболее частые причины заболевания: инфекции мочеполовой системы, варикоцеле, травмы, системные заболевания, прием стероидов и некоторых других препаратов, хронические стрессы, аномалии развития органов мочеполовой системы. В отсутствие выявленных причин заболевания проводят молекулярно-генетические исследования, причем доля генетически обусловленных форм бесплодия в этой группе пациентов может достигать 20% в зависимости от вида отклонения в спермограмме. В качестве молекулярно-генетических причин бесплодия у мужчин рассматривают микроделеции в области AZF на Y-хромосоме, компаунд-гетерозиготы по тяжелой и мягкой мутациям CFTR, как маркеры предрасположенности – длинные аллели CAG-повтора гена андрогенового рецептора (AR) [2].
Микроделеции Y-хромосомы, затрагивающие область AZF (azoospermia factor), могут включать субрегионы AZFa, b и/или c и приводить к утрате генов USP9Y, DBY, UTY, TB4Y и других локусов, участвующих в регуляции сперматогенеза. Одновременные делеции субрегионов AZFa, b или нескольких субрегионов становятся причиной азооспермии, частичные делеции субрегиона AZFc могут приводить к олигозооспермии [3].
Ген CFTR кодирует трансмембранный регулятор проводимости, который участвует в транспорте ионов хлора через плазматическую мембрану и в формировании секрета эпителиальных клеток. Компаунд-гетерозиготы по тяжелой и мягкой мутациям CFTR не имеют клинической картины муковисцидоза, как пациенты с инактивацией обоих аллелей. Однако у них наблюдают проявления гаплонедостаточности – измененную концентрацию ионов хлора и электролитов, повышенную вязкость секрета в мелких протоках желез внешней секреции, что ассоциировано с агенезией семявыносящих протоков (CBAVD – congenital bilateral absence of the vas deferens) [4]. В России с диагностической целью, как правило, проводят определение наиболее частых мутаций CFTR с помощью тест-систем, использующих метод ПЦР [5, 6].
Андрогены играют важную роль в функционировании мужской половой системы и сперматогенезе, реализуя свое действие через андрогеновый рецептор, который кодируется геном AR. В первом экзоне AR расположен полиморфный CAG-повтор, соответствующий полиглутаминовому тракту вариабельной длины. Длина повтора обратно пропорциональна способности рецептора активировать транскрипцию генов-мишеней, что может иметь значение в патогенезе бесплодия у носителей длинных аллелей [7].
Молекулярно-генетические тесты имеют свои показания: в частности, мутации CFTR рекомендуют исследовать у мужчин с обструктивным бесплодием, кроме того, перед молекулярно-генетическим тестированием следует выполнять цитогенетический анализ для исключения хромосомной патологии. Однако зачастую проводят комплексную лабораторную диагностику, при которой одновременно определяют выбранную клиникой (лабораторией) панель биохимических, иммунологических, цито- и молекулярно-генетических маркеров [8, 9]. Целью настоящей работы стало выявление молекулярно-генетических нарушений, которые целесообразно одновременно тестировать у мужчины с неустановленной на текущий момент формой бесплодия для повышения информативности лабораторной диагностики.
Материалы и методы. Характеристика выборки. Проведено ретроспективное исследование, в которое вошли 885 мужчин с бесплодием, обследованных в 2006–2018 гг., среди которых 43% составляли пациенты с азооспермией, остальные – с олигозооспермией. Все пациенты дали информированное согласие. Важным критерием отбора было назначение молекулярно-генетических тестов до получения результатов остальных методов диагностики, что позволило оценить частоту генетических нарушений при обследовании гетерогенной группы первичных пациентов без окончательно верифицированной формы бесплодия.
Выделение ДНК. Геномную ДНК выделяли из образцов периферической крови методом сорбции на кремниевом носителе с помощью набора ДНК-сорб-В (ООО «Некстбио», Россия) или его аналога.
Анализ делеций AZF. Делеции области AZF выявляли методом мультиплексной ПЦР с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ) и окраской нитратом серебра. Амплифицировали по 3 STS-маркера в субрегионах AZFa, b и 4 – в AZFc; всего 12 локусов, разделенных по четырем мультиплексным ПЦР. В качестве контролей на Y-хромосому использовали локусы SRY и AMELX/Y, положительного контрольного образца – ДНК мужчины без делеций на Y-хромосоме. Делеции субрегионов AZF выявляли по отсутствию ПЦР-продуктов соответст...
