Исследование влияния препарата лошадиного коллагена I типа на процесс коллагенеза в экспериментальной модели с помощью измерения экспрессии генов и гистологической оценки тканей

Цель исследования: изучить влияние препарата лошадиного коллагена I типа на процесс коллагенеза на мышиной модели с помощью измерения экспрессии генов в коже мыши (гены: COL1, COL3, MMP1, MMP3, ELN, VCAN, IL-6, TNFα, TGFβ) и выполнения гистологического исследования тканей.
Материалы и методы: В исследовании использовали самок мышей линии BALB/C в возрасте 6–8 недель. Животные содержались в стандартных условиях вивария при контролируемой температуре (22±2 °C), влажности (50±10%) и 12/12-часовом световом режиме с доступом к воде и корму ad libitum. Экспериментальным животным с помощью триммера на дорсальной поверхности выбривали два участка кожи площадью ~3 см² (день 0). На следующий день (день 1) внутрикожно инъецировали в один участок 100 мкл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl, контроль), а в другой – 100 мкл раствора препарата лошадиного коллагена I типа, разведенного в стерильном физиологическом растворе согласно инструкции производителя. В 1 день эксперимента (спустя 24 часа после первого введения препарата) одно из животных умерщвляли и иссекали участки кожи в зонах инъекций. Экспрессию генов измеряли с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (RT-rtPCR).
Гистологический анализ проводили на 21-е, 35-е и 53-и сутки.
Результаты: В 1-й день эксперимента (через 24 часа после первой инъекции лошадиного коллагена I типа) в тканях наблюдалось статистически значимое повышение экспрессии генов COL1 и COL3, кодирующих коллаген I и III типов, – основных структурных белков дермы. Это однозначно указывает на запуск синтеза нового коллагена фибробластами. Дополнительно зафиксировано значительное повышение экспрессии TGFβ – одного из ключевых регуляторов фибробластной активности и дифференцировки, который также известен как мощный индуктор коллагенеза. Гистологические данные подтверждают эти молекулярные наблюдения: на 21-е сутки в опытных образцах выявлено более высокое соотношение фибробластов к общему количеству клеток дермы и более плотная организация коллагеновых волокон, чем в контрольной группе. С учетом того, что фибробласты являются главными продуцентами компонентов внеклеточного матрикса, включая коллаген, их высокая плотность в дерме служит косвенным признаком активации синтетической функции кожи под действием препарата.
Также выявлена тенденция к увеличению толщины дермы на 35-е сутки в опытной группе, что может отражать накопление нового матрикса и структурную перестройку ткани. При этом структура коллагеновых волокон на 35-е и 53-и сутки сохраняла компактность и плотность, что указывает на стабилизацию ремоделированного матрикса.

Введение

Дерма выполняет опорную функцию для сосудистой сети кожи, эпидермиса и его придатков и преимущественно образована внеклеточным матриксом. Этот матрикс представляет собой сложную систему, включающую различные белки, протеогликаны и гликозаминогликаны, синтезируемые и выделяемые фибробластами [1]. Коллаген типа I является самым распространенным белком в коже человека, составляя более 90% ее сухого веса. Уникальные физические свойства коллагеновых волокон придают коже структурную целостность. Фибриллярные коллагены типа I, III и V самостоятельно собираются в более крупные коллагеновые волокна, которые образуют трехмерную структурную сеть по всей дерме [2].

Все фибриллярные коллагены образованы тремя полипептидными цепями, закрученными друг вокруг друга в тройную спираль. При синтезе каждая цепь содержит дополнительные аминокислотные последовательности на концах, которые обеспечивают ее растворимость [1]. Внутри фибробластов эти цепи формируют растворимую тройную спираль, называемую проколлагеном. После секреции в межклеточное пространство концевые пептиды отщепляются под действием ферментов [3]. Этот процесс превращает проколлаген в зрелый коллаген, способный к самосборке в крупные волокна, которые затем стабилизируются за счет ферментативных поперечных сшивок [4].

Ключевыми факторами, регулирующими синтез коллагена фибробластами и его деградацию ферментами, являются механическое напряжение и ультрафиолетовое излучение. Отсутствие механической нагрузки на фибробласты приводит к одновременному повышению продукции коллагеназы и снижению выработки коллагена. Даже кратковременное воздействие УФ-излучения вызывает резкое уменьшение синтеза коллагена (примерно на 80%) и значительное (в сотни раз) увеличение активности матриксных металлопротеиназ [5–10].

В современной косметологии для стимуляции синтеза коллагена и улучшения качества возрастной кожи активно используются коллаген и его пептидные формы. Эти вещества применяют как перорально (в виде биодобавок), так и инъекционно. Основным источником коллагена служат животные ткани, тогда как пептиды получают путем ферментативного расщепления крупных молекул коллагена.

Экспериментальные исследования in vivo подтвердили способность коллагеновых пептидов усиливать пролиферативную активность фибробластов. Под их влиянием клетки дермы начинают активнее продуцировать собственный коллаген, хотя точные молекулярные механизмы этого процесса требуют дальнейшего изучения. Результаты, полученные на изолированных в культуре фибробластах, могут представлять неполную картину воздействия коллагеновых препаратов. Поэтому кожа модельных организмов, в частности мышей линии BALB/C, является наиболее распространенным и удобным объектом тестирования препаратов коллагена. В свете научных данных о пользе коллагена и коллагеновых пептидов для здоровья кожи, исследования, направленные на изучение последствий воздействия экзогенным коллагеном, являются актуальными.

Цель исследования: изучить влияние препарата лошадиного коллагена I типа на процесс коллагенеза на мышиной модели с помощью измерения экспрессии генов в коже мыши (гены: COL1, COL3, MMP1, MMP3, ELN, VCAN, IL-6, TNFα, TGFβ) и выполнения гистологического исследования тканей.

Материалы и методы

Препарат коллагена

В работе был использован коммерческий препарат коллагена, характеристики которого представлены в табл. 1.

Препарат разводили стерильным физиологическим раствором, если это требовалось согласно инструкции.

Животные и общий ход эксперимента

В исследовании использовали самок мышей линии BALB/C в возрасте 6–8 недель в количестве 6 особей. Животные содержались в стандартных условиях вивария при контролируемой температуре (22±2°C), влажности (50±10%) и 12/12-часовом световом режиме с доступом к воде и корму ad libitum. Животных содержали в течение 53 дней. Инъекции коллагена проводили на 1-й, 7-й и 14-й дни эксперимента. На 1-й, 4-й-, 21-й, 35-й и 53-й день умерщвляли по одному животному для отбора образцов на экспрессию генов (дни 1-й и 4-й) и проведения гистологического анализа тканей (21-й, 35-й и 53-й дни). Все процедуры выполняли в соответствии с международными биоэтическими нормами.

Группы животных и режим введения препаратов

Экспериментальным животным с помощью триммера на дорсальной поверхности выбривали два участка кожи площадью ~3 см² (день 0). На следующий день (день 1) внутрикожно инъецировали в один участок 100 мкл стерильного физиологического раствора (0,9% NaCl, контроль), а в другой – 100 мкл раствора препарата лошадиного коллагена I типа, разведенного в стерильном физиологическом растворе согласно инструкции производителя. В первый день эксперимента одно из животных умерщвляли и иссекали участки кожи в зонах инъекций (ри...

Моржанаева М.А., Свечникова Е.В., Старкова Е.Ю., Бабин Ю.Ю., Михеева У.А., Горшкова Е.Н., Старкина О.В., Колегова Т.И., Гладько В.В., Измайлова И.В.