Метод измерения размера клеточного резервуара ВИЧ и определение его у пациентов без опыта приема АРТ

Цель исследования. Разработка метода определения размера резервуара, измерение его у ВИЧ-инфицированных лиц без опыта приема АРТ и анализ его связи с вирусной нагрузкой (ВН), длительностью инфекции и иммунным статусом.
Материалы и методы. Обследованы 268 ВИЧ-инфицированных пациентов без опыта АРТ с известными сроками заражения. На момент взятия крови у пациентов определяли ВН и показатель иммунного статуса. ДНК выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и количественно оценивали методом ПЦР в реальном времени. Размер резервуара рассчитывали как число копий провирусной ДНК к общему числу клеток. Результаты выражали в log10 копий/106 МКПК.
Результаты. Концентрация ДНК ВИЧ варьировала от 0,04 до 3,84 log10 копий ДНК ВИЧ/106 МКПК (медиана – 2,22, межквартильный диапазон – 1,74–2,72 log10 копий ДНК ВИЧ/106 МКПК). Размер резервуара коррелировал с ВН (r = 0,526; p < 0,01), иммунным статусом (r = -0,189; p < 0,05) и длительностью инфекции (r = -0,282; p < 0,01).
Заключение. Концентрация ДНК ВИЧ в качестве маркера размера вирусного резервуара позволяет получить дополнительную информацию о течении заболевания. Можно рекомендовать использовать этот показатель в совокупности с ВН и иммунным статусом для случаев инфекции на ранних стадиях.

Появление и внедрение антиретровирусной терапии (АРТ) в практику оказания помощи людям, живущим с ВИЧ, позволило перевести заболевание в хроническую форму [1]. Продолжительность жизни таких пациентов с высокой приверженностью терапии не отличается от продолжительности жизни людей, живущих без ВИЧ [2]. Но на сегодняшний день полностью излечиться от ВИЧ-инфекции невозможно, и даже при многолетней эффективной терапии полного уничтожения вируса в организме достичь не удается. Причиной этого является существование резервуара ВИЧ [3] – клеток, инфицированных репликативно-компетентным вирусом в разных тканях и анатомических зонах. Такие клетки присутствуют в организме человека, несмотря на длительный прием антиретровирусных препаратов (АРВП) [4]. После прерывания терапии через определенное время вирус, находящийся в латентном состоянии, возобновляет репликацию из-за исчезновения лекарственного подавления, и ВН возрастает [3]. Таким образом, существование резервуара – основная причина необходимости пожизненного регулярного приема АРВП.

Исследования показали, что размер резервуара влияет на множество параметров, таких как скорость прогрессирования болезни [5], риск развития ВИЧ-ассоциированных заболеваний [6, 7], время достижения недетектируемой ВН при приеме АРВП [8]. С. Rouzioux и соавт. [9] установили, что концентрация ДНК ВИЧ в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) является основным предиктором прогрессирования заболевания, снижения количества CD4+-лимфоцитов до уровня < 200 клеток/мкл и наступления СПИДа, независимо ни от концентрации РНК ВИЧ, ни от количества CD4+-лимфоцитов.

ДНК ВИЧ в организме человека может существовать в разных формах: интегрированной в хромосому клетки (интактный и дефектный провирус), и неинтегрированной (кольцевые длинные концевые повторы 1-LTR, 2-LTR и линейная ДНК) [10]. Все эти формы суммарно называются тотальной ДНК ВИЧ.

Для каждой формы существуют свои методы оценки. До недавнего времени «золотым стандартом» измерения вирусного резервуара считался QVOA (Quantitative Viral Outgrowth Assay) [11], но в результате дальнейших исследований стало ясно, что этот метод недооценивает фактический размер вирусного резервуара, потому как не все CD4+-лимфоциты пролиферируют после первого раунда активации. К тому же этот метод оказался дорогим, трудоемким, длительным и неприменимым для клинических исследований. На смену ему пришли методы на основе ПЦР, такие как Alu-PCR [12], IPDA [13] и Q4PCR [14], нацеленные на несколько областей провирусной ДНК, тем самым исключая из анализа дефектные провирусы, содержащие гипермутации, вставки, делеции и др. Коллектив BEAT-HIV Martin Delaney Collaboratory выпускает рекомендации, отдавая приоритет IPDA или Q4PCR для измерения размера резервуара ВИЧ в крови и тканях во время клинических испытаний, связанных с лечением ВИЧ [4]. Эти методы позиционируются как дешевые, быстрые и простые по сравнению с QVOA, позволяющие оценить уровень репликативно-компетентного вируса. Из недостатков исследователи выделяют высокую вариабельность от пациента к пациенту, так как в некоторых случаях наблюдалась значительная частота ложного обнаружения, дефектные провирусы признавались за интактные либо не давали сигнала. Объясняется это полиморфизмом последовательностей в провирусных геномах и требованием гибридизации с третьим и/или четвертым зондом, что снижает чувствительность этих методов [4].

Дефектный провирус может быть трансляционно-активным и «мертвым», то есть неспособным продуцировать вирусные белки [15]. Ввиду этого такой маркер, как тотальная ДНК ВИЧ подвергается критике из-за невозможности дифференциации интегрированной и неинтегрированной форм, а также интактного...

>

Квасов Н.А., Полякова А.К., Лопатухин А.Э., Мурзакова А.В., Шемшура А.Б., Киреев Д.Е.