Мультиплексная ПЦР для дифференциации штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль-Тор с различной эпидемической значимостью

Цель исследования. Разработка способа одновременной идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов V. cholerae биовара Эль-Тор и дифференциации нетоксигенных штаммов на потенциально эпидемически опасные и эпидемически безопасные.
Материалы и методы. Было использовано 167 штаммов V. cholerae О1 биовара Эль-Тор, 6 нетоксигенных штаммов V. cholerae non O1/O139, 5 штаммов бактерий близкородственных видов рода Vibrio и 3 штамма энтеробактерий.
Результаты. Мультиплексную ПЦР на выявление маркерных генов проводили в один прием в 2 реакционных смесях. Для токсигенных эпидемически опасных штаммов характерно образование 4 амплифицированных фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA; для нетоксигенных штаммов, потенциально эпидемически опасных – 3 фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514 и tcpA, а для нетоксигенных эпидемически безопасных – 1 фрагмента, соответствующего гену tcpA, или отсутствие всех детектируемых маркерных генов соответственно.
Заключение. Разработан способ дифференциации штаммов V. cholerae О1 биовара Эль-Тор с различной эпидемической значимостью. Показана специфичность и эффективность разработанной мультиплексной ПЦР, которая может быть использована при проведении эпидемиологических расследований, мониторинговых исследований объектов окружающей среды и для паспортизации штаммов V. cholerae.

Холера – острая диарейная особо опасная инфекция, возбудителем которой является бактерия Vibrio cholerae, продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки, где периодически возникают эпидемии и вспышки этого заболевания. В связи с увеличением миграции населения существует высокая вероятность завоза холеры на неэндемичные территории, включая Российскую Федерацию [1–3]. Возбудителем текущей, седьмой пандемии холеры является V. cholerae биовара Эль-Тор. За развитие основного клинического симптома при холере (водянистой диареи) ответственны гены ctxAB в составе профага СТХφ, кодирующие холерный токсин. Кластер генов tcpA-F, входящий в состав острова патогенности VPI-1, связан с биосинтезом токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТСР), обеспечивающих колонизацию тонкого кишечника человека холерными вибрионами. Эти 2 фактора патогенности необходимы для развития инфекционного процесса при холере, поэтому штаммы, в геноме которых присутствуют гены ctxA и tcpA, являются эпидемически опасными. Кроме этого, такие штаммы в своем геноме имеют 2 острова пандемичности – VSP-I и VSP-II с генами, необходимыми для адаптации к стрессовым условиям окружающей среды [4, 5].

На территории Российской Федерации при мониторинге водной среды нередко выделяют нетоксигенные штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор, не имеющие в своем геноме основных детерминант патогенности (ctxAB−tcpA–). Но время от времени из водной среды, а также от людей выделяются нетоксигенные штаммы холерных вибрионов с неполным набором генов патогенности. Особое значение имеют штаммы, сохранившие в своем геноме гены ТСР (tcpA)1 [6]. Такие штаммы сохраняют способность колонизировать кишечник, что может обусловливать появление вибриононосителей, а также за счет фаговой конверсии способствовать возникновению токсигенной популяции [7, 8]. В связи с этим штаммы холерных вибрионов с генотипом ctxAB−tcpA+ некоторые авторы считают потенциально опасными [9–11]. Впервые об изолятах V. cholerae с генотипом ctxA–tcpA+ сообщили S.M. Faruque и соавт. в 1998 г. [12]. Считалось, что все они представляют потенциальную эпидемическую опасность, так как пили TCP являются рецептором для фага CTXφ. Согласно гипотезе авторов, нетоксигенные штаммы холерных вибрионов с генотипом ctxA–tcpA+, находящиеся в объектах окружающей среды, при попадании в кишечник человека могут быть инфицированы CTXφ-фагом, образовывать токсигенные клоны и в дальнейшем приводить к эпидемическим вспышкам. Образование новых эпидемически опасных клонов определяется условиями как организма человека, так и окружающей среды. Однако в ряде публикаций было указано, что TCP-зависимая передача фага CTXφ между вибрионами происходит преимущественно в условиях in vivo, так как пили TCP V. cholerae биовара Эль-Тор в большей степени образуются в организме хозяина [8, 12, 13]. Для успешного формирования токсигенных клонов из нетоксигенных необходимо одновременное попадание в кишечник как нетоксигенных штаммов с генотипом ctxA–tcpA+, так и фага CTXφ. Такое развитие событий возможно на эндемичных по холере территориях, где открытые водоемы часто контаминируются токсигенными штаммами. На территории Российской Федерации, которая является неэндмичной территорией, в последнее время регистрировали только завозные случаи холеры, обусловленные токсигенными штаммами, а выделение токсигенных штаммов холерных вибрионов из объектов окружающей среды носило единичный характер. Поэтому вероятность одновременного поп...

Агафонова Е.Ю., Агафонов Д.А., Смирнова Н.И.