Новые возможности диагностики инфекции, вызванной HHV-8, с использованием иммуноферментного анализа

Цель исследования. Создание набора реагентов для выявления специфических антител класса G к HHV-8 (Human herpes virus type 8) на основе метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА).
Материалы и методы. Методом ИФА исследовали образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных, здоровых доноров, детей и пожилых лиц на наличие специфических антител к HHV-8 с подтверждением результатов в реакции иммунофлюоресценции. Исследованы активность и перекрестная реактивность нового набора реагентов по отношению к другим герпесвирусам.
Результаты. Созданный набор реагентов для выявления специфических антител класса G к HHV-8 на основе метода твердофазного ИФА соответствует заявленным показателям.
Заключение. Диагностический тест на основе ИФА позволит быстро проводить скрининг большого количества сывороток для выявления лиц с риском развития саркомы Капощи и проводить сероэпидемиологические исследования.

Вирус герпеса человека 8-го типа (Human herpes virus type 8 – HHV-8) или вирус, ассоциированный с саркомой Капоши, по морфологии, структуре и функциям относят к подсемейству γ-герпесвирусов. Он имеет черты, роднящие его с другими представителями семейства Herpesviridae: сходные структурные элементы, похожую организацию генома, общие механизмы репликации. Тем не менее этот вирус имеет ряд уникальных особенностей, делающих его объектом исследований, актуальных для современной медицины и биологии. HHV-8 – лимфотропный вирус, инфицирует в первую очередь лимфоциты человека и связан с развитием В-клеточных лимфом, саркомы Капоши, ангиоиммунобластной лимфаденопатии, болезни Кастлемана и ряда других лимфопролиферативных заболеваний [1, 2].

По сравнению с другими герпесвирусами HHV-8 менее распространен в человеческой популяции (до 25% случаев) [3]. В то же время инфицированность ННV-8 среди больных саркомой Капоши составляет более 90%, а у здоровых доноров крови антитела к нему выявляются только в 2–9% случаев [4].

У людей с нормальным иммунитетом, инфицированных этим вирусом, в большинстве случаев он клинически никак себя не проявляет. Исследования подтверждают возможность длительной персистенции этого вируса у здоровых лиц и его активации в условиях иммуносупресии. Активация и негативное действие HHV-8 могут проявиться только в случае стойкого снижения иммунитета, например, у ВИЧ-инфицированных больных, особенно в стадии СПИДа. По данным клинических наблюдений, у 45% людей, инфицированных ВИЧ и HHV-8, в течение 10 лет развилась саркома Капоши.

В научных публикациях также описано несколько случаев развития саркомы Капоши и выпотной клеточной лимфомы внутренних полостей тела у пациентов в послеоперационном периоде после трансплантации органов. Поэтому в случаях развития иммуносупрессивных заболеваний, при длительной терапии, снижающей иммунитет (после пересадки органов и тканей, проведении химио- или лучевой терапии) возникает необходимость предварительного обследования доноров и пациентов на иммунный статус в отношении ННV-8 для оценки риска развития саркомы Капоши и других лимфопролиферативных заболеваний.

После открытия в 1994 г. HHV-8 и установления его этиопатогенетической связи с саркомой Капоши были разработаны разные лабораторные технологии для выявления инфицирования HHV-8 [3, 5–10]. В первую очередь это серологические методы выявления антител к антигенам HHV-8, такие как реакция иммунофлюоресценции против литических и латентных антигенов [11–16], иммуноблотинг с различными вирусными белками и иммуноферментный анализ (ИФА) с цельным вирусным лизатом, синтетическими пептидами или с конъюгированными конструкциями рекомбинантных белков и синтетических пептидов [11, 16–20]. Получение вирусной культуры в настоящее время применяют в основном для исследовательских целей, изучения особенностей инфекционного процесса с участием HHV-8 и не используют в практическом здравоохранении для диагностических целей [21].

Известны основные иммунодоминантные белки HHV-8, кодируемые открытыми рамками считывания (open reading frame – ORF), такие как ORF 73 (латентный), ORF 59 (ранний), ORF 65 (мажорный капсидный), ОRF 26 (минорный капсидный) и ORF К8.1 (поверхностный). В серологических тестах (ИФА, иммуноблотинг) показана высокая реактивность латентного (ORF 73) и литического (ORF 65 и К8.1) антигенов с сыворотками крови, полученными от больных СПИДом, ассоциированных с саркомой Капоши. Ранние разработанные ИФА тест-системы не являются диагностически эффективными, поскольку, как показали результаты их научных испытаний, выявляют иммунные антитела в сыворотках крови преимущественно во время острой или активной клинической формы инфекции [22, 23].

Обследование пациентов из групп риска по развитию заболеваний, этиологическим агентом которых является HHV-8 (пациенты со СПИДом, онкологические больные, наркозависимые, пациенты с трансплантацией органов), а также доноров органов и тканей требует использования диагностических тест-систем с более высокими качественными характеристиками. Медицинская лабораторная технология ИФА позволяет быстро проводить скрининг большого количества образцов крови, что необходимо для оперативного выявления лиц с риском развития саркомы Капоши, а также для проведения эпидемиологических исследований на основе выявления серологических маркеров инфицирования HHV-8.

В связи с этим нашей целью была разработка эффективного диагностического набора реагентов для твердофазного ИФА, предназначенного для скрининга образцов сыворотки (плазмы) крови на наличие антител к HHV-8.

Материалы и методы

При конструировании новой тест-системы для твердофазного ИФА по выявлению антител к HHV-8 были использованы:

• разборные полистироловые планшеты для иммунологических реакций с плоским дном лунок (Nunс, Дания, кат. № 446469);
• иммуносорбент – очищенный рекомбинантный антиген HHV-8, содержащий основные иммунодоминантные последовательности белков генома HHV-8, TRX-...

Амелина Е.А., Арсеньева В.А., Марданлы С.С., Марданлы С.Г., Ротанов С.В.