Оценка эффективности и возможности оптимизации методики анализа уровня микро-РНК-371-3 (HSA-miR-371-3p) в плазме для диагностики и мониторинга эффекта терапии герминогенных опухолей у мужчин

Обоснование. Выбор оптимальной тактики лечения больных герминогенными опухолями (ГО) базируется на определении совокупности прогностических факторов. Практически все больные ГО с хорошим прогнозом могут быть излечены путем рационального сочетания лекарственного и хирургического методов. В то же время результаты лечения пациентов с плохим прогнозом остаются крайне неудовлетворительными. Одним из способов повышения эффективности терапии является поиск современных молекулярно-биологических факторов, способных оптимизировать и персонализировать лечебный подход.
Цель исследования: создание системы ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) анализа миР-351-3,
предварительная оценка диагностической эффективности анализа концентрации этой молекулы, определение возможности (ей) оптимизации технологии и перспектив внедрения в практику нового метода мониторинга ГО на основе ОТ-ПЦР-анализа миР-371-3.
Методы. Дизайн, синтез и анализ системы ОТ-ПЦР детекции миР-371-3 были проведены с использованием отечественной реагентики, оценка диагностической ценности метода была проведена с использованием материала (плазмы) пациентов с верифицированным диагнозом ГО (n=13) и здоровых доноров (n=15). Для разработки метода специфической изоляции миР-371-1 из плазмы были использованы суперпарамагнитные частицы (СПМЧ) и ДНК-зонд, комплементарный миР-371-3. Результаты. Создана оригинальная система для количественного анализа миР-371-3 метoдом ОТ-ПЦР (ttTR-PCR), показана аналитическая эффективность этой системы в широком диапазоне концентраций детектируемой молекулы. Проведена оценка концентрации миР-371-3 в плазме пациентов с ГО и здоровых доноров. Для увеличения чувствительности технологии в целом разработана и протестирована методика специфического выделения миР-371-3 из плазмы с помощью СПМЧ.
Заключение. Качественная оценка миР-371-3 в плазме представляется перспективным методом мониторинга эффективности терапии ГО, но технология анализа этой молекулы требует оптимизации и масштабной клинической валидации.

Обоснование

Герминогенные опухоли (ГО) у мужчин являются одним из наиболее распространенных новообразований в возрастной группе с 15 до 35 лет. Согласно мировой статистике, на долю этой патологии приходится до 1,5% от всех онкологических и до 5% от онкоурологических заболеваний мужчин [1]. Максимальный показатель относительной заболеваемости ГО наблюдается у пациентов в возрасте 25–29 лет и составляет 16,65%. Неуклонный рост числа больных ГО во всем мире на протяжении последних 40–50 лет привел к практически двукратному увеличению заболеваемости. Специфический характер заболеваемости определяет особую социальную значимость этой патологии, необходимость оптимизации существующих и разработку новых диагностических и лечебных методов.

В настоящее время ГО являются одними из наиболее «курабельных» злокачественных новообразований. За последние два десятилетия показатели 5-летней выживаемости выросли с 65 до 95% [2]. При этом клиническую актуальность сохраняют проблемы прогнозирования течения заболевания, ранней и точной оценки эффекта химиотерапии, выбор тактики наблюдения или дальнейшего лечения [3]. Решение этих проблем требует углубленных исследований биологии заболевания и поиска новых диагностических маркеров. В частности, изучение особенностей гистогенеза ГО позволяет разрабатывать новые подходы к оценке риска развития заболевания, прогнозированию характера течения и ответа на химиотерапию [4]. Согласно международным и отечественным клиническим рекомендациям, у всех пациентов с ГО яичка исследуются опухолевые маркеры (а-фетопротеин – АФП, хориогонадотропин – ХГЧ, лактатдегидрогеназа – ЛДГ), и с учетом степени повышения концентрации этих маркеров проводится оценка прогноза и выбор терапии [5]. Но повышение этих показателей наблюдается у 40–80% пациентов, зависит от гистотипа опухоли, наблюдается в очень широком диапазоне, что затрудняет клиническую интерпретацию [6]. Поиск и валидация новых маркеров ГО ведутся активно по разным направлениям, включая тканеспецифические гликопротеины [7], внеклеточную ДНК [8] и циркулирующие опухолевые клетки [9]. Особое внимание привлекают циркулирующие в плазме микро-РНК.

Микро-РНК – это короткие регуляторные молекулы, контролирующие стабильность белок-кодирующих РНК и эффективность белкового синтеза [10]. К настоящему времени описано несколько тысяч молекул этого класса. Для клеток каждой ткани характерен набор, или «профиль», мажорных микро-РНК, который изменяется при развитии патологических состояний, включая неопластическую трансформацию [11]. Поэтому анализ микро-РНК в биопсийном материале рассматривается как перспективный метод диагностики онкологических заболеваний. В дополнение к известным внутриклеточным функциям микро-РНК в составе белковых комплексов или мембранных везикул входят в состав физиологических жидкостей. Определенный «профиль» молекул микро-РНК характерен для циркулирующей плазмы, хотя лишь недавно был описан полный спектр микро-РНК плазмы и нормальный диапазон изменения концентраций «мажорных» молекул [12]. Можно предполагать, что патологическая пролиферация или метаболитическая активность клеток определенной ткани может приводить к появлению в циркулирующей плазме нехарактерных молекул микро-РНК. Это предположение подтверждается многочисленными исследованиями: определенные типы циркулирующих микро-РНК рассматриваются как перспективные маркеры онкологических заболеваний [13], включая колоректальный рак [14], рак молочной железы [15], рак легкого [16]. В целом число «тематических» публикаций исчисляется сотнями и коррелирует c относительными показателями заболеваемости и социальной значимостью онкологических заболеваний.

Но пока нет примеров использования диагностических тестов на основе микро-РНК в клинической практике. Для этого существует ряд причин принципиального (биологического) и методологического характера. Во-первых, диапазон физиологических, качественных и количественных изменений «нормального» пула, циркулирующих в плазме микро-РНК, изучен слабо, а «опухоль-специфичность» отдельных молекул имеет относительный характер. Во-вторых, выделение и количественный анализ микро-РНК из плазмы являются нетривиальной задачей, которая имеет разные (NGS, miRNA-arrays, RT-qPCR) трудоемкие и относительно дорогостоящие решения [17]. Наиболее вероятна разработка диагностических методов на основе реакций обратной транскрипции и последующей ПЦР (ОТ-ПЦР), но принятая для анализа белок-кодирующих РНК техника нормализации результатов ОТ-ПЦР пока не приемлема для микро-РНК [18]. Поэтому многочисленные исследования, основанные на сравнении условных групп «пациентов» и «здоровых доноров», дают обнадеживающие результаты, которые пока трудно использовать для решения конкретных клинических задач.

Активность исследований возможности использования циркулирующих микро-РНК в качестве маркера ГО соответствует социальной значимости заболевания. Так, первая работа, в которой был проведен широкий анализ ГО-ассоциированных изменений «профиля» микро-РНК плазмы, ...

М.С. Князева, В.А. Загоруйко, Е.В. Борисов, Е.И. Сидина, Н.С. Никифорова, М.А. Слюсаренко, И.В. Назарова, А.И. Семенова, А.К. Носов, С.А. Проценко, А.В. Малек