Разработка дот-анализа для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита с применением рекомбинантного EDIII-ВКЭ антигена и IgY-антител

Цель исследования. Оценка эффективности применения рекомбинантного аналога домена III оболочечного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) (EDIII-ВКЭ) и куриных IgY-антител при разработке диагностического набора для выявления IgG к ВКЭ методом дот-анализа.
Материалы и методы. Изготовлены зонды на основе коллоидного золота и вторичных иммунореагентов (Au-SpA, Au-SpG, Au-IgG-a/Hum и Au-IgY-a/Hum) и проведено исследование их в дот-анализе иммуноглобулинов человека классов А, М и G. На основе зондов и EDIII-ВКЭ созданы экспериментальные наборы для дот-иммуноанализа IgG к ВКЭ.
Результаты. Экспериментальная оценка характеристик наборов с использованием панелей образцов сывороток крови, содержащих и не содержащих IgG к ВКЭ, а также панелей образцов, содержащих антитела к возбудителям других флавивирусных инфекций (лихорадка денге и желтая лихорадка) показала 100% чувствительность и специфичность дот-анализа, что свидетельствует о высокой селективности рекомбинантного антигена EDIII-ВКЭ. Зонды на основе поликлональных IgY-a/Hum не уступают в чувствительности и обеспечивают на 10–20% более интенсивный оптический сигнал по сравнению с зондами на основе мышиных моноклональных IgG-а/Hum.
Заключение. Зонды на основе IgY-a/Hum и рекомбинантный антиген EDIII-ВКЭ можно рассматривать в качестве перспективных реагентов для анализа антител, в частности, для дот-анализа на плоских подложках. Созданные на их основе наборы могут применяться для диагностики клещевого энцефалита в отдаленных районах со слабо развитой лабораторной инфраструктурой.

Россия – один из крупных ареалов инфекционных заболеваний, передающихся клещами. Ежегодно к врачам различных специальностей по поводу присасывания клеща обращается несколько сотен тысяч пациентов1.

Известно, что клещи служат переносчиками целого ряда болезней человека, среди которых одним из самых распространенных (около 2000 заболеваний в год) является клещевой энцефалит (КЭ) [1], вирус которого (ВКЭ) относящийся к роду Flavivirus семейства Togaviridae, вызывает заболевание, характеризующееся лихорадкой, переходящей в потенциально смертельный энцефалит [2]. Для этого заболевания важна ранняя диагностика для своевременного назначения этиотропной терапии. Наиболее часто присасыванию клещей подвержены сельские жители, а также участники полевых экспедиций и туристы в отдаленных районах, у которых диагностика методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) не может быть оперативно выполнена. Кроме того, обследование пациентов с применением ПЦР эффективно только в период вирусемии, который при флавивирусных инфекциях не превышает 7 дней [3]. В более поздний период лабораторная диагностика основывается на выявлении серологических маркеров – специфических IgM и IgG [4]. Для ранней диагностики в условиях сельских медицинских учреждений со слабо развитой диагностической базой, куда первично поступают пациенты с присасыванием клещей, необходимы простые тесты, позволяющие быстро выявлять антитела к ВКЭ.

Ранее мы сообщали о разработке платформы автономных наборов для выявления антител методом дот-анализа [5]. Эти наборы включают комплект аналитических матриц (пластиковые подложки с иммобилизованными в виде отдельных пятен реагентами захвата) и аналитические ванны, заполненные готовыми рабочими растворами. Анализ включает последовательные инкубации подложки в исследуемом образце и рабочем растворе зонда – реагента детекции, связанного с коллоидным золотом. Не связавшиеся с подложкой компоненты после каждой инкубации удаляются отмывками, а иммобилизованное на подложке в результате иммунной реакции коллоидное золото проявляется путем каталитического восстановления на его поверхности серебра из раствора, содержащего растворимую соль серебра и восстановители [6]. Усиление окраски и дополнительная ее стабилизация могут быть достигнуты при переводе серебра в его сульфид путем обработки в щелочном растворе тиомочевины. Такие наборы позволяют в течение 60–70 мин при комнатной температуре выявлять специфические антитела в образцах сыворотки или плазмы крови, не требуют дополнительного оборудования и энергообеспечения, допускают визуальный учет результатов с несложной интерпретацией. Однако изготовление таких наборов требует тщательного подбора иммунокомпонентов для обеспечения необходимых чувствительности и специфичности анализа (мультиплексный).

Цель исследования: оценка эффективности применения рекомбинантного аналога домена III оболочечного гликопротеина Е ВКЭ (EDIII-ВКЭ) и куриных IgY-антител при разработке диагностического набора для выявления IgG к ВКЭ методом дот-анализа.

Материалы и методы

В работе использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин, лимонную кислоту, метол, натрия азид, полный адъювант Фрейнда, тетрахлорзолотую кислоту (ТХЗК [HAuCl4)] и твин-20 (Sigma-Aldrich, США); натрия цитрат (Na3C6H5O7*5.5H2O), о.с.ч. («Реахим», Россия), другие отечественные реактивы с квалификацией не ниже ч. д. а. В качестве материала подложки использовали сплошной белый пластик на основе ПВХ Zenofol-print («Зенон», Новосибирск).

Иммунореагенты

В качестве аналитов в сравнительных экспериментах использовали антитела человека классов М, А и G («Имтек», Россия), а в качестве реагентов детекции – нативный белок А из Staphylococcus aureus (SpA), нативный белок G стрептококковый (SpG), моноклональные антитела мыши к IgG человека (МКАТ IgG-a/Hum; Sigma-Aldrich, США), и куриные антитела против IgG человека (IgY-a/Hum), приготовление которых описано ниже.

Исследованы:

• панель образцов, содержащих и не содержащих антитела к ВКЭ, включающая 40 положительных и 20 отрицательных сывороток крови, предоставленная БУЗ Республики Алтай «Центр по профилактике и борьбе со СПИД» и охарактеризованная с использованием коммерческого набора реагентов для иммуноферментного выявления и количественного определения иммуноглобулинов класса G к ВКЭ Вект...

Полтавченко А.Г., Филатов П.В., Ерш А.В., Ушкаленко Н.Д., Шаньшин Д.В., Колосова Е.А., Щербаков Д.Н.