Разработка оптимального состава защитных сред для лиофилиза¬ции референтного штамма Yersinia pestis EV Niieg и его генетически измененных вариантов, несущих в геноме детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам

Цели исследования. Разработка оптимального состава защитных сред для лиофилизации референтного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ и его генетически сконструированных вариантов Y. pestis EVA и Y. pestis EV76R16 соответственно с хромосомной и плазмидной устойчивостью к антибиотикам.
Материалы и методы. Оптимизацию количественных соотношений компонентов защитных сред на основе стандартной сахарозо-желатиновой среды с тиомочевинной (СЖТ) проводили с использованием методов математического планирования эксперимента (ПФЭ 23) и (ПФЭ 24). Расчет осуществляли по лицензированной программе случайных чисел – методом Монте-Карло. Результаты экспериментальных исследований, проведенных по предложенной матрице, были использованы для построения математических моделей процессов оптимизации защитных сред. На основе полученных моделей, построенных для каждого из взятых в опыт штаммов Yersinia pestis EV Niig., Y. pestis EVA и Y. pestis EV76R16 без проведения натурных экспериментов, виртуально, рассчитаны оптимальные количественные соотношения компонентов защитных сред. Проверку эффективности разработанных сред проводили опытным путем.
Результаты. Протективные свойства полученных защитных сред в результате сбалансированного количественного подхода были повышены для референтного штамма в 2 раза, для штамма EV76R16 – в 1,5 раза, для Y. pestis EVA – в 3 раза в сравнении с контрольной средой СЖТ.
Заключение. Применение методов математического планирования эксперимента позволило скорректировать количественный состав защитных сред для каждого из 3 взятых в опыт штаммов, сократив время проведения опыта и снизив материальные затраты по амортизации применяемого оборудования.

Для активной иммунопрофилактики чумы в Российской Федерации выпускается лицензированный, имеющий государственную регистрацию медицинский иммунобиологический (лекарственный) препарат Vaccine plague1. Он представляет собой взвесь живых бактерий вакцинного штамма чумного микроба EV линии НИИЭГ, лиофилизированного в сахарозо-желатиновой среде с тиомочевиной (СЖТ) или в других рекомендованных защитных средах.

Многоэтатапность процесса биотехнологии вакцины, большое количество факторов и их взаимосвязей, влияющими на конечный результат, (условия выращивания культуры, качество питательной и защитной сред, время и температура высушивания суспензии, режим замораживания и сублимация растворителя в вакуумной камере, а также другие технологические приемы) обусловливают необходимость применения системного подхода к оптимизации этапов биотехнологии вакцины [1, 2].

Получение генетически измененных вариантов штамма Yersinia pestis EV, несущих в геноме детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам, стимулирует разработку новых защитных сред для конструирования полирезистентных вакцин. Системный подход с использованием математических моделей был применен ранее для оптимизации этапов биотехнологии таких вакцин, как гриппозная гликопротеидная мультивалентная вакцина «Грипповак», полиомиелитная и антирабическая вакцины [3, 4]. Первые опыты математического моделирования живой сухой чумной вакцины (разработка защитных сред и режимов лиофилизации) были проведены в 1990-х годах [5, 6]. В последнее десятилетие успешно проводятся научно-исследовательские работы по математическому моделированию технологии получения живой сухой таблетированной вакцины против чумы [7, 8].

Одним из главных факторов при лиофилизации микроорганизмов является состав защитных сред, который обеспечивает защиту микробных клеток от повреждений, возникающих в процессе лиофилизации (замораживание, удаление воды из замороженных суспензий под вакуумом и др.) [9, 10].

Цели исследования – оптимизация с помощью методов полного факторного эксперимента количественных соотношений ингредиентов защитной среды СЖТ, рекомендуемой регламентом, для лиофилизации референтного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, и разработка защитных сред для его генетически измененных вариантов, несущих в геноме детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам.

Материалы и методы

Экспериментальные серии вакцины готовили на основе 3 вакцинных штаммов чумного микроба: Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (референтный штамм) и 2 генетически сконструированных штаммов с хромосомной и плазмидной устойчивостью к антибиотикам – Y. pestis EVA и Y. pestis EV76 R16 [11]. Культуры выращивали на плотной питательной среде «СО», состоящей из непищевого сырья: автолизата селезенки, гидролизата белка пшеничных отрубей, хлористого натрия, сернокислого натрия, агара японского пластинчатого или Корсаковского и дистиллированной воды (рН 7,4) [12]. Лиофилизацию осуществляли на камерной лиофилизационной установке LZ–9CP фирмы «Фригера» (Чехия).

Стандартная пропись защитной среды СЖТ (10% сахарозы, 1% желатины, 1% тиомочевины; рН 7,6) была использована в качестве контрольной. Для получения оптимальных композиций на основе компонентов среды СЖТ в работе был применен метод полного факторного эксперимента с 3 (ПФЭ 23) и 4 переменными (ПФЭ 24) [13].

В соответствии с этим методом количест...

Лопатина Н.В.