Эпидемиология и Инфекционные болезни. Актуальные вопросы №4 / 2021
Сравнительный анализ скрининговых методов детекции точечных мутаций на примере выявления мутации N501Y в коронавирусе SARS-CoV-2
Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия
Цель исследования. Сравнение различных методов выявления точечных нуклеотидных мутаций в рамках изучения генетического разнообразия коронавируса SARS-CoV-2.
Материалы и методы. Исследование проводили на выборке образцов от пациентов, содержащих генетический материал коронавируса SARS-CoV-2. Были использованы 3 метода: в качестве золотого стандарта – фрагментное секвенирование по Сэнгеру, ПЦР в реальном времени и петлевая изотермическая амплификация.
Результаты. Проведено генотипирование 372 образцов от пациентов с помощью секвенирования, обнаружены 54 образца, относящихся к геноварианту Альфа, 7 – к геноварианту Бета и 25 – к геноварианту B.1.1.523. Показана возможность использования как метода ПЦР в реальном времени, так и петлевой изотермической амплификации для выявления мутации N501Y коронавируса SARS-CoV-2 на различных образцах, в том числе и для различных геновариантов (Aльфа, Бета).
Заключение. Использование скрининговых методов на основе ПЦР дает возможность не только снизить экономические и временные затраты на генотипирование образцов коронавируса SARS-CoV-2, но и увеличить охват исследования за счет получения результатов для образцов, не пригодных для секвенирования.
С развитием пандемии COVID-19 и эволюцией вируса SARS-CoV-2 уже в конце 2020 г. стали появляться сообщения о появлении его новых генетических вариантов [1]. Первоначально эти варианты обозначались как британский и африканский по названию страны происхождения. Впоследствии они были обозначены Альфа и Бета после введения ВОЗ классификации геновариантов коронавируса SARS-CoV-2 с обозначением буквами греческого алфавита [2]. Оба этих варианта достаточно быстро распространились в Великобритании и странах Африки, а затем начали активно распространяться и на территории других стран [3–7].
Отличием вариантов Альфа и Бета от доминировавшего до их появления варианта вируса SARS-CoV-2 (содержащего мутацию D614G в S-белке) является присутствие дополнительных мутаций в различных областях генома коронавируса, 8 таких мутаций расположены в области S-белка (табл. 1). Характерными мутациями геноварианта Альфа являются замены N501Y, A570D и делеции del_HV69-70 и del_Y144, а для варианта Бета – замены D80A, E484K, N501Y и делеция del_LLA241-243. В литературе высказывается предположение, что роль замены N501Y состоит в усилении связывания S-белка коронавируса SARS-CoV-2 с ACE2-рецептором человека, что облегчает проникновение вируса в клетку и, как следствие, способствует повышению его трансмиссивности и более активному распространению в человеческой популяции [8–10].
ВОЗ постоянно ведет наблюдение за распространением генетических вариантов SARS-CoV-2 и регулярно формирует список таких вариантов с делением на 3 группы: варианты, вызывающие опасения (Variants of Concern – VOC); варианты, вызывающие интерес (Variants of Interest – VOI) и варианты, требующие наблюдения (Variants Under Monitoring – VUM) [11].
К концу сентября 2021 г. в список VOC-вариантов входили Альфа, Бета, Гамма, Дельта; в список VOI-вариантов – Лямбда, Мю, а в список VUM-вариантов – еще 14 геновариантов. Списки мутаций в S-белке для вариантов VOC и VOI приведены в табл. 1, из которой видно, что 4 из 6 актуальных геновариантов содержат мутацию N501Y.
Несмотря на доминирование линии Дельта на территории Российской Федерации с июня 2021 г. по настоящее время (конец октября 2021 г.) [12], разработка простых и недорогих скрининговых методов детекции точечных мутаций вируса SARS-CoV-2 является актуальной задачей. Такая система скрининга позволит снизить трудозатраты и финансовые расходы на секвенирование в рамках изучения генетического разнообразия вируса и позволит контролировать появление или завоз новых геновариантов. На примере выявления мутации N501Y мы сравним использование 3 методов: секвенирования методом Сэнгера, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) и петлевой изотермической амплификации (Loop Mediated Isothermal Amplification – LAMP).
Мониторинг за генетическим разнообразием вируса SARS-CoV-2 проводится во всех странах. Основным методом, который используется для решения этой задачи, в настоящий момент является секвенирование. Полногеномное секвенирование позволяет получить максимум информации об образце и максимально достоверно определить принадлежность к той или иной генетической линии. Однако существенным его недостатком является высокая стоимость и достаточно длительный (до 4 дней) и сложный процесс подготовки проб.
Секвенирование отдельных фрагментов генома вируса с целью генотипирования проводят, как правило, методом Сэнгера [13]. Это позволяет снизить стоимость процесса, однако так же, как и полногеномное секвенирование, требует достаточно длительной процедуры пробоподоготовки и проведения секвенирования (3 дня от поступления пробы до получения результата). Кроме стадии выделения РНК вируса и проведения обратной транскрипции для получения кДНК при секвенировании необходимо проводить амплификацию целевых фрагментов генома, их очистку и затем уже пробоподготовку собственно для секвенирования по стандартным протоколам. Неоспоримым достоинством данного метода является высокая точность определения генетической последовательности и более низкая стоимость по сравнению с методами полногеномного секвенирования.
Следует отметить, что и полногеномное секвенирование, и фрагментное секвенирование методом Сэнгера чувствительны к качеству биоматериала, особенно если размеры получаемых ампликонов составляют больше 500 пн. При транспортировке, хранении и повторяющихся циклах заморозки–разморозки образцы, особенно в случае РНК-содержащих вирусов, могут значительно деградировать, что затруднит или сделает невозможным получение результатов методами секвенирования.
Отдельную нишу среди методов детекции точечных мутаций занимают методы на основе ПЦР [14–16]. Для этой цели широко используется такой хорошо известный вариант метода, как...
