Транскрипционный профиль в клетках кумулюса у женщин со сниженным овариальным резервом в протоколах стимуляции функции яичников в различные фазы менструального цикла в программах экстракорпорального оплодотворения

Цель исследования. Изучить возможность использования транскрипционного профиля в клетках кумулюса для прогноза качества эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом в протоколах стимуляции суперовуляции в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла. Материал и методы. Проанализированы 160 образцов кумулюсных клеток от 40 пациенток со сниженным овариальным резервом, проходивших программу экстракорпорального оплодотворения/ интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ЭКО/ИКСИ). Полученные ооцит-кумулюсные комплексы разделялись на 2 группы в зависимости от фазы проведенного протокола лечения I группа (17 женщин – 70 образцов) ооциты, полученные в фолликулярной фазе цикла, II группа (23 женщины – 90 образцов) – ооциты, полученные в лютеиновой фазе цикла. Полученные кумулюсные клетки были разделены на три класса в зависимости от качества эмбрионов согласно морфологическим критериям оценки: 1-й класс – эмбрионы хорошего качества (n=42), 2-й класс – эмбрионы удовлетворительного качества (n=43), 3-й класс – эмбрионы неудовлетворительного качества (n=17). Был исследован уровень экспрессии мРНК 10 генов в кумулюсных клетках методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени: HAS2, PTGS2, GREM1, VCAN, ITPKA, ALCAM (CD166), SDC4, CALM2, SPSB2 и TP53I3. Результаты. При анализе эмбриологических показателей статистически значимых различий выявлено не было. Среднее число полученных ооцитов составило 3,6±1,9 в группе стимуляции в фолликулярной фазе, 4,2±2,0 в группе стимуляции в лютеиновой фазе (р>0,05). Количество бластоцист составило 1,6±1,4 и 1,9±1,8 соответственно (р>0,05). В кумулюсных клетках эмбрионов хорошего качества выявлено повышение уровня экспрессии мРНК генов HAS2 в 1,8 раза, VCAN в 2 раза и PTGS2 в 2,9 раза, и снижение уровня мРНК гена ITPKA в 1,9 раза (р<0,05). Предложена логистическая регрессионная модель прогноза качества эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом, учитывающая уровень экспрессии мРНК генов VCAN, HAS2 и PTGS2 (чувствительность и специфичность метода составили 90,5 и 70,6% соответственно). Уровень экспрессии мРНК гена VCAN является наиболее информативным маркером для оценки качества эмбрионов согласно морфологическим критериям оценки. Выявлено статистически значимое повышение уровня экспрессии мРНК генов VCAN, SDC4, и TP53I3 в клетках кумулюса во II группе исследования (р=0,003, p=0,005, p<0,001 соответственно). Заключение. Уровни экспрессии мРНК генов VCAN, HAS2 и PTGS2 могут быть использованы как предикторы хорошего качества развивающихся эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом. Индукция суперовуляции в лютеиновой фазе менструального цикла не оказывает отрицательного влияния на потенциал развития ооцитов и качество получаемых эмбрионов.

Проблема недостаточного ответа яичников на стимуляцию гонадотропинами в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин репродуктивного возраста со сниженными показателями овариального резерва волнует специалистов на протяжении длительного времени [1]. Женщины со сниженными показателями овариального резерва составляют 24–48% всех пациенток, подвергающихся стимуляции функции яичников в программах вспомогательных репродуктивных технологий [2, 3]. В анамнезе у данной группы пациенток отмечаются неоднократные неэффективные попытки лечения в программах ЭКО/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), что оказывает влияние как на их психологическое состояние, так и на социальное положение в обществе.

«Волновая теория» развития фолликулов в яичниках явилась основой для проведения стимуляции суперовуляции не только в фолликулярной фазе, но и в лютеиновой фазе цикла у женщин со сниженным овариальным резервом [4].

В 2014 г. Y. Kuang с соавт. ввели понятие «двойная стимуляция», подразумевающее стимуляцию в фолликулярную и в лютеиновую фазу в рамках одного менструального цикла [5]. Результаты исследований ряда авторов показали, что двойная стимуляция является эффективным подходом для лечения бесплодия у пациентов со снижением овариального резерва [2, 5].

В настоящее время остается актуальным вопрос о качестве ооцитов и эмбрионов, получаемых в результате стимуляции функции яичников в различные фазы менструального цикла. Известно, что в современной практике качество переносимых эмбрионов в основном оценивается согласно морфологическим критериям, таким как скорость, своевременность и равномерность деления клеток, форма бластомеров, степень их фрагментации и другие [6]. Однако точность такого метода отбора эмбрионов недостаточно высокая, и в последние годы появляется все больше исследований, демонстрирующих недостатки морфологического критерия оценки качества эмбрионов [7, 8]. В связи с этим возникает необходимость поиска новых методов, с помощью которых возможно определение качества эмбрионов и их потенциала к имплантации.

Данные проведенных на сегодняшний день исследований свидетельствуют о том, что кумулюсные клетки могут быть использованы для определения потенциала развития ооцитов, оценки качества эмбриона и эффективности протокола стимуляции яичников [8–11].

Известно, что кумулюсные клетки, окружающие и питающие ооцит, образуются в процессе фолликулогенеза на стадии формирования полости внутри фолликула из низкодифференцированных предшественников – клеток гранулезы [12, 13].

Кумулюсные клетки тесно связаны с ооцитом посредством специальных щелевых контактов, позволяющих осуществлять метаболический обмен и транспорт сигнальных молекул [14, 15]. Таким образом, кумулюсные клетки: 1) координируют созревание ооцитов с развитием фолликулов; 2) оказывают влияние на ядерное и цитоплазматическое созревание ооцита; 3) обеспечивают энергией процесс возобновления мейотического созревания ооцита; 4) стимулируют гликолиз, аминокислотный транспорт и биосинтез стеролов [13, 16].

По результатам проведенных на сегодняшний день исследований доказано, что уровень экспрессии потенциально значимых генов в клетках кумулюса коррелирует с показателями качества ооцитов, развитием эмбрионов на предимплантационном этапе и частотой наступления беременности [8, 17–21]. Однако известно, что данные исследования проводились исключительно в группах женщин с нормальным овариальным резервом.

Таким образом, нами впервые была проведена оценка транскрипционного профиля в клетках кумулюса у пациенток со сниженным овариальным резервом.

Для проведения исследования мы выбрали гены, участвующие в контроле процессов клеточной репродукции (CALM2, ITPKA, SPSB2), передачи внутриклеточной информации и формировании внеклеточного матрикса (SDC4, HAS2, PTGS2(COX2), GREM1), миграции, пролиферации клеток и ангиогенеза (ALCAM (CD 166), VCAN), программируемой гибели клеток (TP53I3), следовательно, потенциально связанные с процессами фолликулогенеза, оогенеза и развитием эмбрионов.

Цель исследования: изучить возможность использования транскрипционного профиля в клетках кумулюса для прогноза качества эмбрионов у женщин со сниженным овариальным резервом в протоколах стимуляции суперовуляции в фолликулярную и лютеиновую фазы менструального цикла.

Материал и методы исследования

На базе отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции и лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России проведено проспективное исследование случай-контроль.

В кумулюсных клетках методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени был исследован уровень экспрессии мРНК 10 генов: генов внеклеточного матрикса (гиалуронан-синтетаза 2 (HAS2), версикан (VCAN), молекула клеточной адгезии активированных лейкоцитов (ALCAM или CD166)), генов, регулирующих передачу внут...

Богатырева Х.А., Мишиева Н.Г., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Мартазанова Б.А., Лапина В.С., Королькова А.И., Мартынова М.В., Абубакиров А.Н.