STROKE №4 / 2017
Внеклеточные митохондрии в цереброспинальной жидкости и неврологическое восстановление после субарахноидального кровоизлияния
Neuroprotection Research Laboratories, Departments of Radiology and Neurology and Clinical Proteomics Research Center, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston; Departments of Critical Care Medicine, Neurology, and Neurosurgery, University of Pittsburgh, PA; Department of Neurology, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA; Cerebrovascular Research Center, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, China; Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, Boston.
Предпосылки и цель исследования. Результаты последних исследований показывают, что внеклеточные митохондрии могут участвовать в патофизиологии инсульта. В настоящем исследовании мы оценили функциональную значимость эндогенных внеклеточных митохондрий в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у крыс и людей после субарахноидального кровоизлияния (САК). Методы. Использовали стандартную модель САК у крыс, в которой для перфорации церебральной артерии выполняли внутрипросветное введение нити, приводящее к экстравазации крови в субарахноидальное пространство. Через 24 и 72 ч после развития САК оценивали неврологические исходы и проводили стандартный анализ с красителем JC1 (5,5’,6,6’-тетрахлор-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианионидид) для количественной оценки потенциалов мембран митохондрий в ЦСЖ. Для дальнейшего подтверждения результатов экспериментов с использованием модели на крысах отбирали образцы ЦСЖ у 41 пациента с САК и 27 лиц контрольной группы. Потенциалы мембран митохондрий измеряли с помощью окрашивания JC1, а корреляцию с клиническими исходами оценивали через 3 месяца. Результаты. В стандартной модели САК у крыс внеклеточные митохондрии в ЦСЖ выявляли через 24 и 72 ч после индукции САК. Результаты анализа окраски JC1 показали, что потенциалы мембран митохондрий в ЦСЖ после САК снижались по сравнению с таковыми в группе псевдовмешательства. В образцах ЦСЖ людей также были обнаружены внеклеточные митохондрии, и интенсивность окрашивания JC1 после САК также снижался. Кроме того, более высокие потенциалы мембран митохондрий в ЦСЖ коррелировали с хорошим клиническим восстановлением через 3 месяца после развития САК. Выводы. В настоящем исследовании по проверке концепции продемонстрировали, что внеклеточные митохондрии могут являться биомаркером целостности головного мозга и его восстановления после повреждения.
Митохондрии представляют собой внутриклеточный источник энергии. Поскольку головной мозг является органом с высоким уровнем метаболизма, митохондрии играют центральную роль в церебральной физиологии и патофизиологии. При развитии повреждения или заболевания митохондрии могут быть ключевым регулятором нейродегенерации, а также нейровосстановления в зависимости от их функционального состояния [1–3].
В последнее время, на основе изучения клеточных моделей и моделей на животных, появились данные о том, что митохондрии могут высвобождаться во внеклеточное пространство и передаваться из клетки в клетку [4–8]. В центральной нервной системе нейроны сетчатки могут передавать митохондрии астроцитам для их утилизации и рециркуляции [9], а астроциты головного мозга могут высвобождать митохондрии, которые потенциально могут поддерживать должное состояние нейропластичности после очаговой церебральной ишемии у мышей [10]. Однако еще предстоит выяснить, оказывают ли влияние внеклеточные митохондрии на неврологические исходы in vivo.
В настоящем исследовании мы изучали данные экспериментальной модели на крысах и данные пациентов с субарахноидальным кровоизлиянием (САК), чтобы ответить на 3 вопроса. Во-первых, можно ли обнаружить функционирующие внеклеточные митохондрии в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ)? Во-вторых, изменяется ли каким-либо образом состояние внеклеточных митохондрий после развития повреждения или заболевания головного мозга? В-третьих, если состояние митохондрий действительно изменяется после развития заболевания, могут ли внеклеточные митохондрии отражать внутриклеточную метаболическую целостность жизнеспособного вещества головного мозга, тем самым представляя собой новый класс потенциальных биомаркеров церебрального повреждения и восстановления?
МЕТОДЫ
Модель САК у крыс
Все эксперименты проводили в соответствии с утвержденными организационными протоколами, в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по содержанию и использованию лабораторных животных. Использовали взрослых самцов крыс линии Sprague-Dawley (320–350 г, Charles River Laboratories), анестезию выполняли изофлураном (1,5% в смеси 30%/70% кислорода/газообразной закиси азота). После стандартных процедур инициировали развитие САК путем введения 3,0 проленовой одноволоконной нити в наружную сонную артерию, далее ее проводили во внутреннюю сонную артерию до области бифуркации ВСА на переднюю и среднюю мозговые артерии. После этого нить дополнительно продвигали еще на 5 мм вперед для прокола стенки артерии, а затем ее быстро извлекали. Животным группы псевдовмешательства выполняли те же процедуры, но без введения нити. Период восстановления продолжался в течение 24 ч после вмешательства, а затем с помощью стандартной 5-пунктовой неврологической шкалы оценивали неврологические исходы у всех крыс [11]. ЦСЖ (не менее 50 мкл для каждого животного) извлекали из большой цистерны головного мозга для проведения анализа JC1 (5,5’, 6,6’-тетрахлор-1,1’, 3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианионид). Шесть крыс включили в группу псевдовмешательства, и у 24 крыс инициировали развитие САК. В целом, 64% (9 из 14) или 40% (4 из 10) крыс выжили через 24 ч и через 72 ч после развития САК соответственно. Относительно высокие показатели летальности отражают тяжесть кровоизлияния в этой модели у крыс, и в отличие от пациентов с САК в этих моделях не было предусмотрено оказание медицинской помощи в отделении интенсивной терапии (см. ниже).
Зачисление пациентов с САК и сбор образцов ЦСЖ
В крупное когоротное исследование биомаркеров САК проспективно зачисляли пациентов в течение первых 96 ч после развития спонтанного нетравматического САК, а затем собирали образцы крови и ЦСЖ и хранили их. Образцы ЦСЖ собирали только в том случае, если пациенту по клиническим показаниям было выполнено наружное вентрикулярное дренирование. Исключали пациентов с САК травматического генеза, с беременностью, в терминальной стадии почечной или печеночной недостаточности, с внутричерепными злокачественными опухолями или инфекционным менингитом. В контрольную группу включили пациентов, принимавших участие в испытании с выведением ЦСЖ, посвященном изучению нормотензивной гидроцефалии. Всех пациентов зачисляли после получения информированного согласия и в соответствии с протоколами, одобренными комиссией по биомедицинской этике. В обеих группах пациентов, образцы ЦСЖ, сыворотки и плазмы крови после сбора сразу же подвергали обработке. Образцы центрифугировали при комнатной температуре со скоростью 3900 об/мин в течение 15 минут, супинат разделяли на аликвоты и немедленно замораживали на сухом льду и хранили при -80 °C до проведения анализа.
Клинические переменные и оценка исходов
Критерием наличия ангиографического вазоспазма было уменьшение диаметра любого внутримозгового сосуда ...