STROKE №4 / 2017

Внеклеточные митохондрии в цереброспинальной жидкости и неврологическое восстановление после субарахноидального кровоизлияния

31 декабря 2017

Neuroprotection Research Laboratories, Departments of Radiology and Neurology and Clinical Proteomics Research Center, Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, Boston; Departments of Critical Care Medicine, Neurology, and Neurosurgery, University of Pittsburgh, PA; Department of Neurology, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA; Cerebrovascular Research Center, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, China; Department of Neurology, Massachusetts General Hospital and Program in Neuroscience, Harvard Medical School, Boston.

Предпосылки и цель исследования. Результаты последних исследований показывают, что внеклеточные митохондрии могут участвовать в патофизиологии инсульта. В настоящем исследовании мы оценили функциональную значимость эндогенных внеклеточных митохондрий в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у крыс и людей после субарахноидального кровоизлияния (САК). Методы. Использовали стандартную модель САК у крыс, в которой для перфорации церебральной артерии выполняли внутрипросветное введение нити, приводящее к экстравазации крови в субарахноидальное пространство. Через 24 и 72 ч после развития САК оценивали неврологические исходы и проводили стандартный анализ с красителем JC1 (5,5’,6,6’-тетрахлор-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианионидид) для количественной оценки потенциалов мембран митохондрий в ЦСЖ. Для дальнейшего подтверждения результатов экспериментов с использованием модели на крысах отбирали образцы ЦСЖ у 41 пациента с САК и 27 лиц контрольной группы. Потенциалы мембран митохондрий измеряли с помощью окрашивания JC1, а корреляцию с клиническими исходами оценивали через 3 месяца. Результаты. В стандартной модели САК у крыс внеклеточные митохондрии в ЦСЖ выявляли через 24 и 72 ч после индукции САК. Результаты анализа окраски JC1 показали, что потенциалы мембран митохондрий в ЦСЖ после САК снижались по сравнению с таковыми в группе псевдовмешательства. В образцах ЦСЖ людей также были обнаружены внеклеточные митохондрии, и интенсивность окрашивания JC1 после САК также снижался. Кроме того, более высокие потенциалы мембран митохондрий в ЦСЖ коррелировали с хорошим клиническим восстановлением через 3 месяца после развития САК. Выводы. В настоящем исследовании по проверке концепции продемонстрировали, что внеклеточные митохондрии могут являться биомаркером целостности головного мозга и его восстановления после повреждения.

Митохондрии представляют собой внутриклеточный источник энергии. Поскольку головной мозг является органом с высоким уровнем метаболизма, митохондрии играют центральную роль в церебральной физиологии и патофизиологии. При развитии повреждения или заболевания митохондрии могут быть ключевым регулятором нейродегенерации, а также нейровосстановления в зависимости от их функционального состояния [1–3].

В последнее время, на основе изучения клеточных моделей и моделей на животных, появились данные о том, что митохондрии могут высвобождаться во внеклеточное пространство и передаваться из клетки в клетку [4–8]. В центральной нервной системе нейроны сетчатки могут передавать митохондрии астроцитам для их утилизации и рециркуляции [9], а астроциты головного мозга могут высвобождать митохондрии, которые потенциально могут поддерживать должное состояние нейропластичности после очаговой церебральной ишемии у мышей [10]. Однако еще предстоит выяснить, оказывают ли влияние внеклеточные митохондрии на неврологические исходы in vivo.

В настоящем исследовании мы изучали данные экспериментальной модели на крысах и данные пациентов с субарахноидальным кровоизлиянием (САК), чтобы ответить на 3 вопроса. Во-первых, можно ли обнаружить функционирующие внеклеточные митохондрии в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ)? Во-вторых, изменяется ли каким-либо образом состояние внеклеточных митохондрий после развития повреждения или заболевания головного мозга? В-третьих, если состояние митохондрий действительно изменяется после развития заболевания, могут ли внеклеточные митохондрии отражать внутриклеточную метаболическую целостность жизнеспособного вещества головного мозга, тем самым представляя собой новый класс потенциальных биомаркеров церебрального повреждения и восстановления?

МЕТОДЫ

Модель САК у крыс

Все эксперименты проводили в соответствии с утвержденными организационными протоколами, в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по содержанию и использованию лабораторных животных. Использовали взрослых самцов крыс линии Sprague-Dawley (320–350 г, Charles River Laboratories), анестезию выполняли изофлураном (1,5% в смеси 30%/70% кислорода/газообразной закиси азота). После стандартных процедур инициировали развитие САК путем введения 3,0 проленовой одноволоконной нити в наружную сонную артерию, далее ее проводили во внутреннюю сонную артерию до области бифуркации ВСА на переднюю и среднюю мозговые артерии. После этого нить дополнительно продвигали еще на 5 мм вперед для прокола стенки артерии, а затем ее быстро извлекали. Животным группы псевдовмешательства выполняли те же процедуры, но без введения нити. Период восстановления продолжался в течение 24 ч после вмешательства, а затем с помощью стандартной 5-пунктовой неврологической шкалы оценивали неврологические исходы у всех крыс [11]. ЦСЖ (не менее 50 мкл для каждого животного) извлекали из большой цистерны головного мозга для проведения анализа JC1 (5,5’, 6,6’-тетрахлор-1,1’, 3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианионид). Шесть крыс включили в группу псевдовмешательства, и у 24 крыс инициировали развитие САК. В целом, 64% (9 из 14) или 40% (4 из 10) крыс выжили через 24 ч и через 72 ч после развития САК соответственно. Относительно высокие показатели летальности отражают тяжесть кровоизлияния в этой модели у крыс, и в отличие от пациентов с САК в этих моделях не было предусмотрено оказание медицинской помощи в отделении интенсивной терапии (см. ниже).

Зачисление пациентов с САК и сбор образцов ЦСЖ

В крупное когоротное исследование биомаркеров САК проспективно зачисляли пациентов в течение первых 96 ч после развития спонтанного нетравматического САК, а затем собирали образцы крови и ЦСЖ и хранили их. Образцы ЦСЖ собирали только в том случае, если пациенту по клиническим показаниям было выполнено наружное вентрикулярное дренирование. Исключали пациентов с САК травматического генеза, с беременностью, в терминальной стадии почечной или печеночной недостаточности, с внутричерепными злокачественными опухолями или инфекционным менингитом. В контрольную группу включили пациентов, принимавших участие в испытании с выведением ЦСЖ, посвященном изучению нормотензивной гидроцефалии. Всех пациентов зачисляли после получения информированного согласия и в соответствии с протоколами, одобренными комиссией по биомедицинской этике. В обеих группах пациентов, образцы ЦСЖ, сыворотки и плазмы крови после сбора сразу же подвергали обработке. Образцы центрифугировали при комнатной температуре со скоростью 3900 об/мин в течение 15 минут, супинат разделяли на аликвоты и немедленно замораживали на сухом льду и хранили при -80 °C до проведения анализа.

Клинические переменные и оценка исходов

Критерием наличия ангиографического вазоспазма было уменьшение диаметра любого внутримозгового сосуда ...

С.Г.-Я. Чоу, Дж. Лан, Е. Эспозито, М.М. Нинг, Л. Баладж, К. Ли, Е.Г. Ло, К. Хайакава
Статья платная, чтобы прочесть ее полностью, вам необходимо произвести покупку
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.