Взаимосвязь содержания регуляторов пролиферации и апоптоза с активностью протеинкиназы р38 в мононуклеарных клетках периферической крови у реконвалесцентов внебольничной пневмонии

Исследованы молекулярные показатели, отражающие состояние стресс-лимитирующих систем мононуклеарных лейкоцитов (МНК) цельной крови у пациентов, перенесших внебольничную пневмонию (ВБ). Цель исследования. Изучение характера зависимости между уровнем фосфорилирования терминальной протеинкиназы р38, отражающей состояние сигнального пути, и содержанием в клетке компонентов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели у реконвалесцентов ВБ. Материал и методы. Обследованы 30 пациентов мужского пола с бактериальной ВБ нетяжелого течения на 15–17-е сутки заболевания, перед выпиской из стационара. Контрольную группу составили 15 практически здоровых молодых лиц из числа доноров крови. В работе оценивалось содержание в клетках компонентов MAPK/SAPK и JAK/STAT сигнальных путей, содержание протеина р53 и цитохрома С. Также в клеточных супернатантах исследовали уровень молекул, контролирующих апоптоз и пролиферацию, членов семейства фактора некроза опухоли альфа (растворимых форм рецепторов DR5 и DcR3, лигандов TRAIL, TWEAK, BAFF, LIGHT), а также концентрацию антиоксидантов. Уровень этих показателей исследовали в зависимости от активности протеинкиназы р38, оцениваемой по уровню ее фосфорилирования. Результаты. У пациентов, перенесших ВП на фоне возрастания уровня протеинкиназы р38, отмечено повышение содержания в МНК протеина р53, а также усиление фосфорилирования ингибитора фактора транскрипции NF-κB. Также выявлено статистически значимое повышение уровня фосфорилирования белка RB, растворимой формы DR5, TRAIL и BAFF. Указанные изменения сопровождались снижением уровня фосфорилирования JAK2, STAT3 и CREB, а также концентрации TWEAK, LIGHT и цитохрома С. Значимых изменений содержания DcR3, STAT5A и АОС в группах с различной активностью р38 выявлено не было. Проведенный линейный регрессионный анализ выявил статистически значимую положительную взаимосвязь активности р38 с уровнем фосфорилирования белка ретинобластомы, STAT3, IκB, JNK и отрицательную с уровнем фосфорилирования JAK2. Заключение. Активность MAPK/SAPK-сигнального пути в МНК реконвалесцентов ВП находится в антагонистичных отношениях к JAK/STAT-сигнальному пути, ослабляя его активность со снижением чувствительности клеток к соответствующим цитокинам. При этом повышение фосфорилирования р38 ассоциировано с повышением фосфорилирования IκB, определяя транскрипцию генов, контролирующих апоптоз, пролиферацию и клеточную дифференцировку. Повышение экспрессии гена BAFF и усиление продукции цитокинов способствует активации В-лимфоцитов, при этом секреция TRAIL усиливает апоптоз чувствительных клеток. Таким образом, активация р38 в МНК может способствовать повышению резистентности организма и противоопухолевой защиты. Проапоптотическая функция р38 может реализовываться за счет стимуляции продукции р53, экспрессии на клетках DR5 и продукции ими TRAIL, тогда как пролиферация и дифференцировка В-лимфоцитов может быть усилена через стимуляцию продукции BAFF, что, очевидно, определяется ее влиянием на ядерную транскрипцию через модуляцию функциональной активности IκB.

Митоген-активируемый/стресс-активи­руемый (MAPK/SAPK) молекулярный каскад играет важную роль в обеспечении реактивности иммунокомпетентных клеток (ИКК) к разнообразным внешним стимулам и запуске ответа острой фазы (ООФ). При этом реализация клеточных реакций в рамках ООФ проявляется активацией клеток, усилением продукции ими активных форм кислорода (АФК), антимикробных пептидов, а также цитокинов [1]. Синтезируемые в рамках ООФ цитокины, связываясь с соответствующими цитоплазматическими рецепторами и воздействуя через сигнальные пути, среди которых JAK/STAT-сигнальный путь, инициируют воспалительный ответ, служащий важнейшей стадией процесса саногенеза.

При этом инициация ООФ требует активации транскрипционных факторов NF-κB и АР-1, что обеспечивается протеинкиназами JNK и p38 [2, 3]. Вместе с тем в отдельных случаях стимуляция сигнального пути сопровождается инициацией процесса апоптоза, вызываемого отдельными цитокинами, входящими в семейство фактора некроза опухоли (ФНО), в частности ФНОα, TRAIL, TWEAK, BAFF и др. Продукция цитотоксическими Т-лимфоцитами и NK-клетками, отдельных представителей цитокинов семейства ФНО, определяет противоопухолевую резистентность организма [3, 4]. Вместе с тем в зависимости от конкретных условий данные факторы могут стимулировать клеточную пролиферацию и дифференцировку, способствовать опухолевому росту. При этом влияние данных факторов на процессы пролиферации находится под контролем внутриклеточных механизмов, эффекторами которых являются протеины р53 и белок ретинобластомы (RB), предупреждающие избыточную активацию данных процессов [5].

Таким образом, MAPK/SAPK-сигнальный путь играет важную роль в первичном клеточном ответе на внешние стимулы, от активности которого зависит дальнейшая судьба клетки и ее жизненный цикл. В связи с этим представляет интерес исследование зависимости между ключевыми молекулярными механизмами в зависимости от активности MAPK/SAPK-сигнального пути.

На основании вышеизложенного целью настоящего исследования стало изучение характера зависимости между уровнем фосфорилирования терминальной протеинкиназы р38, отражающей состояние сигнального пути и содержание в клетке компонентов, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели у реконвалесцентов внебольничной пневмонии (ВП).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В соответствии с целью настоящей работы обследованы 30 пациентов мужского пола с бактериальной ВП нетяжелого течения на 15–17-е сутки заболевания, перед выпиской из стационара. Средний возраст обследованных пациентов основной группы составил 25±5,5 лет. Контрольную группу составили 15 практически здоровых молодых лиц из числа доноров крови в возрасте от 20 до 33 лет (средний возраст 26±4,3 года).

Материалом для исследования служила венозная кровь, забиравшаяся в утренние часы из локтевой вены обследуемых лиц. Для проведения исследования внутриклеточных маркеров 1 мл цельной крови вносили во флакон, содержащий 4 мл среды DMEM, гепарин (2,5 ЕД/мл), гентамицин (100 мкг/мл) и L-глютамин (0,6 мг/мл). Подготовленные таким образом образцы помещались на 3 и 24 ч в термостат при 37 °C с последующим выделением на градиенте фиколл-верографина (ρ=1,077) мононуклеарных лейкоцитов (МНК) и приготовлением лизатов, для чего использовали 1 мл клеточной суспензии содержащей 0,5×106 МНК [6]. Выделенные таким образом МНК дважды отмывали в фосфатно-солевом буфере, после чего лизировали, используя б...

С.С. Бондарь, О.В. Гук, И.В. Терехов, В.С. Никифоров