STROKE №4 / 2012

Аберрантный нейрогенез после инсульта. Исследование Retroviral Cell Labeling

1 января 2012

Предпосылки и цель исследования. Нейрогенез в зубчатой ​​извилине у взрослых является уникальной формой пластичности головного мозга, стимуляция которой происходит после инсульта. Исследовали морфологические свойства новых клеток зернистого слоя, образующихся и развивавшихся после ишемического инсульта, и изучили способность этих вновь образованных нейронов правильно интегрироваться в существующие гиппокампальные сети. Методы. Использовали две известные модели индукции развития небольших кортикальных инфарктов (модель фототромбоза) или крупных полушарных инфарктов (модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии). Новые клетки зернистого слоя метили через 4 дня после инсульта путем интрагиппокампальной инъекции ретровирусного вектора, кодирующего зеленый флуоресцентный белок, а морфологию вновь образованных нейронов анализировали с помощью полуавтоматической системы Neurolucida и конфокального лазерного сканирующего микроскопа через 6 недель. Результаты. Приблизительно в 5–10% вновь образованных клетках зернистого слоя обнаружили выраженные морфологические аномалии, включающие дополнительные базальные дендриты, а после окклюзии средней мозговой артерии еще и эктопическое расположение клеток. Степень морфологических изменений была выше после крупных инфарктов и, по всей вероятности, зависела от тяжести ишемического повреждения. Повышенное количество грибовидных шипов на поверхности аберрантных нейронов позволяет предположить наличие стабильной синаптической интеграции. Тем не менее во вновь образованных нейронах после инсульта с регулярным постоянством также выявляли изменения в ветвлении дендритов и морфологии шипов. Выводы. Выраженная стимуляция нейрогенеза после инсульта в зубчатой извилине совпадает с повышением скорости интеграции нейронов, которые могут способствовать развитию функциональных нарушений и гипотетически участвовать в патогенезе адаптационных нарушений, когнитивных дефицитов или эпилепсии, часто наблюдаемых у пациентов, перенесших инсульт.

Нейрогенез в гиппокампе взрослых является уникальной формой структурной пластичности мозга, которая играет особую роль не только под воздействием физиологических стимулов, но и при повреждениях головного мозга, таких как инсульт, эпилепсия или черепно-мозговая травма. По всей видимости, регуляция образования, миграции, дифференцировки и созревания вновь образованных нейронов в зубчатой извилине происходит таким образом, что позволяет нейронам четко интегрироваться в существующие гиппокампальные сети [1–3]. После ишемии головного мозга происходит выраженная стимуляция пролиферации и дифференцировки клеток-предшественников нейронов в субгранулярной зоне зубчатой извилины (ЗИ), что приводит к значительному увеличению скорости нейрогенеза [4–6]. На сегодняшний день неизвестно, происходит ли полная интеграция большего числа вновь образованных после инсульта нейронов в гиппокампальную сеть? В экспериментальных исследованиях было показано, что эпилептический статус также является мощным стимулятором нейрогенеза в ЗИ у взрослых [7, 8], тем не менее это сопровождается нарушением интеграции этих новых клеток зернистого слоя в гиппокампальную сеть [9–11]. S. Jessberger и соавт. [10] описали наличие аберрантных морфологических изменений в виде дополнительных базальных дендритов, направленных к хилусу у значительного числа вновь образованных нейронов, а в некоторых случаях эктопическое расположение вновь образованных клеток. Эти морфологические изменения, как известно, приводят к увеличению частоты повторного возбуждения в сети [12, 13] и могут являться ключевым компонентом развития эпилепсии.

В настоящем исследовании изучили тонкую морфо- логию вновь образованных после инсульта нейронов в качестве индикатора структурной интеграции в существующие сети. С этой целью использовали ретровирусное мечение клеток, позволяющее детализировать морфологическую реконструкцию дендритов и шипов вновь образованных нейронов для изучения постинсультного нейрогенеза при небольших ограниченных кортикальных инфарктах и крупных ишемических инфарктах в бассейне средней мозговой артерии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что инсульт приводит к морфологически аберрантной интеграции вновь образованных клеток в ЗИ у взрослых, при этом степень нарушений напрямую зависит от размера ишемического повреждения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Модель инфаркта

Исследование провели на 43 самцах крыс линии Wistar. Животных содержали в стандартных условиях проживания в обычных клетках (по 4 особи в клетке).

Предоставляли достаточное количество пищи и воды. Все эксперименты были одобрены немецким комитетом по использованию и уходу за лабораторными животными в соответствии с европейскими директивами.

Модель фототромбоза

После анестезии с использованием 2,5–3,5% изофлурана в смеси O2/N2O животных помещали в стереотаксическую рамку, надрезали кожу головы и размещали волоконный световод (2,4 мм в диаметре), подключенный к источнику холодного света (Schott KL 1500, Майнц, Германия), на черепе на 0,5 мм кпереди от брег- мы и на 3,7 мм латеральнее средней линии над сенсомоторной корой передних конечностей. Сразу же после начала освещения (продолжительностью 20 минут) в бедренную вену через катетер вводили краситель бенгальский розовый (1,3 мг/100 мг массы тела в 0,9% NaCl). Во время вмешательства постоянно поддерживали температуру тела на уровне 36,5 °C. Ложнооперированным животным проводили аналогичное вмешательство за исключением светового воздействия на головной мозг.

Модель окклюзии средней мозговой артерии

После описанной выше анестезии с правой стороны выделяли общую сонную, наружную сонную и крыло- небную артерии и лигировали их. Правую внутреннюю сонную артерию окклюзировали с помощью микрохирургической клипсы и впоследствии проводили артериотомию общей сонной артерии. В общую сонную артерию вводили 3,0-монофиламентную нить (Doccol) с закругленным кончиком и продвигали ее вперед через внутреннюю сонную артерию до устья для окклюзии средней мозговой артерии. Через 60 минут нить удаляли, рану закрывали, затем крысы восстанавливались после вмешательства. Ложнооперированным животным (контрольная группа) провели аналогичное вмешательство за исключением окклюзии правой внутренней сонной артерии.

Ретровирусные векторы

Для мечения вновь образованных зернистых нейронов в правой ЗИ использовали ретровирусные векторы CAG- зеленого флуоресцентного белка (GFP) и CAG-красного флуоресцентного белка (RFP) [14]. Вирусные векторы были образованы котрансфектированными НЕК 293 Т-клетками с pCAG-GFP/pCAG-RFP и конструкциями pCMV VSVg и pCMVpg [15] при заключительном титре около 1×107 колониеобразующих единиц/мл.

Дизайн эксперимента

В первой серии экспериментов исследовали морфо- логию вновь образованных после экспериментального ишемического инфаркта клеток зернистого слоя: крыс (n=28, массой 250–270 г) случайным образом разделили на 4 экспериментальные группы и подвергли фототромбозу (ФТ; n=6), псевдо-ФТ (...

Ф. Нив, С. Каинер, Кришка-К, О.В. Витте, Д.К. Ли, К. Редекер
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.