Анализ генетического разнообразия вируса Кемерово и его филогенетические связи с вирусами группы Грейт-Айленд

Вирус Кемерово является арбовирусом, принадлежащим к роду Orbivirus семейства Reoviridae. Он способен вызывать у человека заболевания с симптомами менингоэнцефалита. Современные данные о генетическом разнообразии вируса Кемерово, его базовых эпидемиологических характеристиках и вкладе в структуру инфекций, передающихся клещами, недостаточны. Для изучения генетического разнообразия вируса и его взаимоотношений с родственными вирусами, представителями группы Грейт-Айленд, проведено секвенирование геномов 10 штаммов вируса Кемерово, изолированных из разных источников на территории Российской Федерации в период с 1962 по 1975 гг., и филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей. Установлен процент нуклеотидной идентичности представителей группы Грейт-Айленд по сегменту, кодирующему последовательность белка VP3. На основании полученных данных обсуждаются генетическое родство вирусов группы Грейт-Aйленд и возможные пути их распространения.

Род Orbivirus семейства Reoviridae насчитывает 22 вируса, а также 7 еще не классифицированных изолятов, являющихся кандидатами на признание их самостоятельными видами на основании серологических и филогенетических характеристик [1–9].

С экологической точки зрения все орбивирусы являются арбовирусами и способны инфицировать широкий круг позвоночных хозяев: диких и домашних животных, летучих мышей, птиц, а некоторые – также и человека. В качестве переносчиков и хозяев орбивирусов могут выступать комары, москиты, мокрецы и клещи [2, 10–13]. Традиционно наибольшее внимание исследователей уделялось 4 представителям рода Orbivirus, вызывающим экономически значимые заболевания сельскохозяйственных животных: вирусам синего языка овец (Bluetongue virus, BTV), эпизоотической геморрагической лихорадки (Epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV), африканской чумы лошадей (African horse sickness, AHSV) и энцефалита лошадей (Equine encephalosis virus, EEV) [14]. В то же время роль орбивирусов в патологии человека до сих пор слабо изучена. Для части орбивирусов, передающихся клещами, показана способность вызывать лихорадочные состояния и неврологические нарушения при инфицировании человека [14, 15]. Однако их вклад в структуру заболеваемости инфекциями, передающимися клещами, остается неизвестным. Одним из таких патогенов является вирус Кемерово (KEMV), для которого доказана способность вызывать энцефалит у человека [15, 16].

Вирус Кемерово был выделен в 1962 г. группой советских и чехословацких вирусологов под руководством академика М.П. Чумакова из ликвора пациента с энцефалитом, возникшим после присасывания клеща, а также из клещей вида Ixodes persulcatus [15].

Позже были открыты другие близкородственные вирусу Кемерово виды, рассматриваемые в настоящее время как группа вирусов Грейт-Айленд [17].

До недавнего времени считалось, что ареалом вируса Кемерово является территория Западной Сибири [18]. Однако в исследованиях, проведенных с применением молекулярных методов, показано, что территория циркуляции вируса Кемерово значительно шире и включает не только Сибирь, но и Урал, а также отдельные территории Европейской части Российской Федерации [19]. При этом вирус Кемерово обнаруживается, в том числе, в клещах вида Ixodes ricinus, являющихся переносчиками близкородственного вируса Трибеч (Tribec virus, TRBV), циркуляция которого выявлена на территории Восточной Европы, а также в Молдавии и на юге Украины [20, 21].

Изучение генетической вариабельности вируса Кемерово и других представителей группы Грейт-Айленд затруднено ввиду малого количества расшифрованных полногеномных последовательностей.

Целью нашей работы стала расшифровка геномов штаммов вируса Кемерово, изолированных на территории Российской Федерации в разные годы из разных источников, и сравнение их с ранее опубликованными последовательностями штаммов вируса Кемерово и других представителей группы вирусов Грейт-Айленд.

Материалы и методы

Культивирование вируса

В работе были использованы 10 штаммов вируса Кемерово из коллекции ФГБНУ ««Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова» РАН, полученные в разное время из разных источников, в том числе от человека (табл. 1).

Вирус размножали в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) или в культуре клеток почки сирийского хомячка BHK-21. Вирус наращивали в зараженной культуре в течение 48–72 ч при 37 ˚С, после чего содержащую вирус культуральную жидкость отбирали для последующего выделения РНК.

Выделение РНК

Вируссодержащую культуральную жидкость освобождали от клеточного дебриса центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 мин при 4 ˚С. Супернатант центрифугировали при 25 000 об/мин в течение 4 ч при 4 ˚С. Супернатант удаляли, осадок вирусных частиц тщательно ресуспендировали в 600 мкл Tрис-Натрий-ЭДТА-буфера [10 мМ Трис, 100 мМ хлорида натрия, 1 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА); pH = 8,0] и добавляли 10% (вес/объем) додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1%.

РНК дважды экстрагировали смесью фенола и хлороформа (в объемном соотношении 1:1), зат...

Сафонова М.В., Дедков В.Г., Гмыль А.П., Карганова Г.Г., Сперанская А.С., Неверов А.Д., Федонин Г.Г., Пимкина Е.В., Валдохина А.В., Хафизов К.Ф., Самохина Е.Н., Шипулин Г.А.