Диагностическое значение микробиоты кишечника как одного из ведущих факторов в развитии язвенного колита на фоне сахарного диабета 2-го типа

Аннотация. Частота встречаемости язвенного колита (ЯК) в структуре гастроэнтерологической патологии неуклонно растет. Наличие коморбидных состояний, в том числе сахарного диабета 2-го типа (СД 2), способствует развитию осложненных форм ЯК. Прогрессирующее течение, резистентность к основным группам лекарственных средств ведут к инвалидизации трудоспособного населения. Поиск новых диагностических маркеров может способствовать своевременному началу терапии, что сократит сроки наступления клинической и эндоскопической ремиссии.
Цель – оценить биоразнообразие микробиоты кишечника у пациентов с ЯК и СД 2.
Материал и методы. Проводилось 16S рРНК секвенирование микробиоты кишечника у 100 пациентов (80 – пациенты с ЯК и СД 2, 20 – пациенты с ЯК, 20 – соматически здоровые пациенты). Диагноз ЯК верифицировался с помощью лабораторных и инструментальных методов исследования. Средний возраст обследуемых групп пациентов составил 50,1 ± 8,3 года.
Результаты. В исследуемой группе преобладали пациенты с ЯК легкой степени тяжести. При оценке кишечной микробиоты у пациентов с ЯК и СД 2 выявлено достоверно значимое увеличение количественного содержания родов бактерий, участвующих в углеводном обмене (Akkermansia, Dorea, Collinsella, Lachnospira). Отмечена взаимосвязь между представителями метан-продуцентов и наличием воспалительного процесса при ЯК, увеличение условно-патогенного и патогенного кластера.
Заключение. У пациентов с ЯК установлено увеличение количества представителей Firmicutes по сравнению с группой контроля. При этом возрастание значений численности метан-продуцирующих бактерий может являться одним из неинвазивных критериев оценки тяжести ЯК на фоне СД 2. Полученные сведения, указывающие на новые потенциальные механизмы развития ЯК, могут послужить основой для усовершенствования диагностики и лечения этой патологии при наличии коморбидных состояний.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время среди патологий кишечника наиболее часто встречаются заболевания с аутоиммунным типом воспаления, к которым относится язвенный колит (ЯК). Этиология ЯК остается неизвестной, определены только ведущие факторы, способствующие поддержанию хронического воспаления и аутоагрессии [1]. Данная патология встречается среди пациентов молодого и среднего возрастов (около 40 тыс. человек на территории России), при этом ежегодный прирост частоты ее встречаемости составляет более 11%, в связи с чем актуальной проблемой остается поиск новых маркеров в диагностике ЯК [2].

В результатах современных исследований отмечается важная роль воздействия кишечной микробиоты в развитии воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК). Прогрессирующим фактором воспаления при ЯК может быть дисбаланс между представителями различных кластеров бактерий. Уменьшение микробного биоразнообразия с последующим нарушением метаболизма бактерий способствует развитию этой патологии [3–6]. Есть сведения об участии представителей кишечной микробиоты в гомеостазе глюкозы с последующим нарушением процессов всасывания и снижения чувствительности тканей к инсулину, формированием инсулинорезистентности и сахарного диабета 2-го типа (СД 2). Это обусловлено развитием метаболического дисбиоза у лиц с ВЗК вследствие дисбиоза кишечных групп бактерий [7, 8].

Известно, что у пациентов с ЯК доминирующими типами кишечной микробиоты являются Firmicutes, Bacteroidota. Родовидовые представители этих мироорганизмов могут быть вовлечены в развитие воспалительного процесса и выступать новым биомаркером заболевания. Определение численности представителей кишечной микробиоты, оценка родовидового биоразнообразия может служить вспомогательным диагностическим критерием, способствующим своевременной верификации диагноза для пациентов с ЯК на фоне СД 2, а также другой коморбидной патологии [9, 10].

Цель исследования – оценить биоразнообразие кишечной микробиоты у пациентов с ЯК на фоне СД 2.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Проведено 16S рРНК секвенирование микробиома кишечника у 80 пациентов с ЯК и СД 2, 20 пациентов с ЯК и 20 соматически здоровых пациентов. Средний возраст обследуемых составил 50,1 ± 8,3 года.

Участникам выполнялось исследование лабораторных показателей: общий анализ крови (ОАК), оценка С-реактивного белка (СРБ), фекального кальпротектина (исследовался только при первичном обращении пациентов), глюкозы, липидного спектра (общего холестерина, липопротеидов низкой плотности), гликированного гемоглобина (HbA1c). Забор биоматериалов осуществлялся в период клинической ремиссии симптомов ЯК (поддерживающая терапия была идентичной во всех исследуемых группах – прием препаратов группы 5-аминосалициловой кислоты) в рамках динамического наблюдения на амбулаторном этапе.

В плане коррекции симптомов СД 2 сахаро­снижающая терапия у исследуемых была одинаковой – использование пероральных сахароснижающих средств из группы бигуанидов. Тотальную ДНК выделяли из образцов кала и сыворотки, подвергнутых гомогенизации в лизирующем растворе. Гомогенизация проводилась вместе с шариками, с последующей экстракцией ДНК методом сорбентной колонки. Биоинформатическая обработка полученных результатов выполнялась с применением биоинформатического пайплана, реализованного на языках программирования R v.3.6 и Python3 [11]. На первом этапе обработки последовательности праймеров обрезались для парных прочтений. Прочтения, не содержащие последовательности праймеров, удалялись. Затем производилось удаление прочтений с плохим качеством (балл Phred не менее 10) и коротких прочтений (не менее 200 пар нуклеотидов) [12]. После определения вариантов последовательностей прочтения конкатенировали, а полученные последовательности использовали для таксономической классификации (метод Naive Bayes) с применением референсной базы данных SILVA v138 [13, 14]. Идентификация родов бактерий осуществлялась посредством алгоритма точного совпадения в DADA2 по предварительно обработанным соответствующим образом последовательностям SILVA v138 с помощью пользовательских скриптов.

Оценка метаболического потенциала микроб­ного сообщества у исследуемых групп пациентов в рамках данного исследования не проводилась.

Для расчета индекса разнообразия кишечной микробиоты (индекс Шеннона) на вход пакета vegan языка программирования R была подана матрица, содержащая общее количество вариантов последовательности ампликонов (ASV) на родовом уровне. Для парного сравнения индексов биоразнообразия использовался U-тест Манна – Уитни. С целью выявления особых таксонов применительно к каждой группе выполнялся частичный дискриминантный анализ по методу наименьших квадратов (sPLS-DA) при помощи программы multiomix (пакет программ mixOmics) на языке программирования R для установления параметров, максимально увеличивающих разли...

С.Н. Лагутина, А.А. Пашкова, В.В. Дудурич, Л.Г. Данилов, Е.Д. Ермаченко