STROKE №4 / 2010
Достижения в геномных исследованиях инсульта: что мы узнали и на каком этапе мы находимся?
Аннотация. В результате научно-технического прогресса в области геномного анализа инсульта сделан шаг вперед – от исследования ассоциаций генов-кандидатов до исследования полногеномных ассоциаций (ИПГА). В агностическом ИПГА в рамках одного эксперимента оценивают до 90% общего числа генетических вариаций, что создает более прочную основу для выявления новых генетических факторов биохимических и клеточных механизмов, лежащих в основе развития инсульта. Учитывая появление большого числа ИПГА, исследователи инсульта и клиницисты должны уметь правильно интерпретировать результаты ИПГА. Таким образом, мы рассматриваем основные элементы дизайна, методов проведения, способов представления результатов и интерпретации ИПГА в контексте исследования инсульта. По данным последних 8 докладов об ИПГА при инсульте, ни один локус не был установлен в двух ИПГА с полногеномным уровнем значимости. Кроме того, до сих пор не обнаружили признаков наличия значимой ассоциации между инсультом и локусом, для которого было доказано наличие ассоциации по результатам ранее проведенных исследований кандидатных генов при инсульте. Обсуждаются некоторые особенности подхода и будущие направления геномики инсульта, в т. ч. использование промежуточных фенотипов, менделевской рандомизации, феномики и глубокого ресеквенирования. Необходимо проведение качественных междисциплинарных исследований с адекватной мощностью, объединяющих знания из области клинической медицины, эпидемиологии, генетики и молекулярной биологии для полной характеристики генетических факторов, способствующих развитию инсульта.
Инсульт является клинической кульминацией многих сложных процессов и взаимодействия метаболических путей, ни один из которых по отдельности не является необходимым или достаточным для того, чтобы привести к исходу, затрудняющему анализ потенциальных этиологических факторов [1]. Метаболические пути в целом отражают клинические подтипы инсульта – геморрагический или ишемический. Многие гены, кодирующие белки, которые участвуют в этих путях, уже были изучены с использованием подхода “ген-кандидат”. Однако с молекулярной точки зрения широкий спектр различных патофизиологических состояний является потенциальным благоприятствующим фоном, к этим состояниям относятся: сердечная аритмия и дисфункция миокарда, дисфункция тромбоцитов и нарушение коагуляции, нарушения, приводящие к повреждению структуры и функции стенки артерий, воспалительные и иммунные нарушения. Несмотря на то, что такие технологии, как генотипирование и секвенирование появились более 20 лет назад, до недавнего времени был достигнут лишь незначительный прогресс в определении молекулярно-генетических детерминант инсульта. Тем не менее разработка точных и высокопроизводительных методов с использованием микрочипов для проведения анализа генотипа по всему геному субъекта исследования коренным образом изменило масштабы и характер генетических данных, которые теперь можно получить для понимания такого сложного заболевания как инсульт. В частности, исследование полногеномных ассоциаций (ИПГА), позволяющее агностически оценить особенности ассоциации между вариациями в геноме и точно охарактеризовать инсульт и связанные с ним фенотипы, является усовершенствованной экспериментальной основой для быстрого выявления новых патогенетических механизмов и подтверждения роли ранее известных механизмов. В данном обзоре мы описываем интерпретацию результатов ИПГА применительно к исследованиям инсульта, представляем краткие выводы и синтез результатов ИПГА инсульта, а также предлагаем будущие направления геномного анализа инсульта. С учетом того, что теория и методика ИПГА были рассмотрены в общих чертах ранее [2, 3], целевой читательской аудиторией этого обновленного краткого обзора должны быть исследователи инсульта и клиницисты.
Варианты генома человека
Каждый диплоидный геном человека содержит около 6 млрд. нуклеотидных оснований [4], из которых 0,5% различаются у любых двух человек. По инициативе Международного консорциума HapMap (International HapMap Consortium) (www.hapmap.org), а вскоре и в рамках проекта 1000 Genomes project (www.1000genomes.org) в реестр были занесены данные о спектрах вариаций человеческой ДНК с поразительным разрешением. У людей различают почти 12 млн. распространенных точечных мутаций, называемых однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП) [3]. Каждый ОНП, включая кодирующие и некодирующие ОНП, потенциально может повлиять на экспрессию или функцию белка.
Разработка плотных микрочипов олигонуклеотидных ДНК позволила исследователям быстро определить генотип 1 млн. полиморфизмов у одного человека в рамках единственного эксперимента. Поскольку близлежащие ОНП из-за свойства неравновесного сцепления связаны не случайно, анализ “всего” 1 млн. полиморфизмов может предоставить дополнительную информацию о 90% оставшихся неопределенных ОНП с помощью процесса, называемого импутация [5]. Таким образом, большинство ОНП в полном геноме человека можно выявлять на основе результатов единственного эксперимента с использованием микрочипов [5]. Кроме того, в том же эксперименте с использованием микрочипов можно генотипировать и изучить митохондриальную ДНК. Учитывая скорость и точность обнаружения вариаций ОНП в геноме, стало возможным выявление определенных полиморфизмов, которые с большей вероятностью можно обнаружить у лиц, перенесших инсульт.
Дополнительный уровень изменения, называемый вариация числа копий (ВЧК), подразумевает дупликацию и делецию больших участков ДНК, как правило, включающих более 1000 пар оснований. Последние данные свидетельствуют о том, что крупные ВЧК (видимые цитогенетически и составляющие более 100 кб), как правило, встречаются с частотой 5%, в то время как меньшие ВЧК (5–50 кб) встречаются более часто (5–50%) [6, 7]. В связи с изменением дозы гена, повреждением его структуры или делеции, ВЧК могут оказывать значительное влияние на функции генов, и их уже рассматривали в качестве причины развития ряда сложных фенотипов, таких как болезнь Крона [8] и индекс массы тела (ИМТ) [9]. Стало возможным изучение распространенных ВЧК, называемых полиморфизмами числа копий, при сложных генетических признаках, включая инсульт, поскольку те же микрочипы с полногеномными данными об ОНП, могут быть повторно проанализированы с помощью различного программного обеспечения и предоставить дополнительную информацию о ВЧК и полиморфизмах числа копий [6, 10].
Дизайн ИПГА
При проведении ИПГА можно предположить широкий диапазон точек приложения, в т. ч. ретроспективное исследование по типу “случай-контроль” и проспективное когортно...
