Эффективность молекулярно-генетических методов диагностики инфекций, вызванных S. pneumoniae и H. Influenzae

Цель исследования. Разработка и валидация набора реагентов для количественного определения ДНК S. pneumoniae и H. influenzae методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Оценка его эффективности в сравнении с другими методами лабораторной диагностики.
Материалы и методы. Исследовали изоляты S. pneumoniae (181) и H. influenzae (101); биологический материал от пациентов с внебольничной пневмонией (ВП) тяжелого (60 взрослых) и среднетяжелого (66 детей) течения. Сравнивали результаты ПЦР-РВ, бактериологического метода и экспресс-теста на определение антигена S. pneumoniae в моче.
Результаты. В структуре возбудителей тяжелых ВП преобладали S. pneumoniae (63%), H. influenzae встречались у 32% пациентов. S. pneumoniae обнаруживали методом ПЦР-РВ в 2–3 раза чаще, чем другими методами диагностики. Методом ПЦР-РВ ДНК H. influenzae обнаружена в мокроте 19 больных, культура выделена только у 1. Этиологию ВП у детей установили в 91% случаев, из них вирусную – в 18%. S. pneumoniae выявлены у 17%, H. influenzae – у 23%.
Заключение. Показана высокая эффективность ПЦР-РВ для диагностики инфекций, вызванных S. pneumoniae и H. influenzae. При диагностике ВП методом ПЦР-РВ материал из нижних дыхательных путей более информативен, чем из верхних.

Streptococcus (S.) pneumoniae и Haemophilus (H.) influenzae могут как бессимптомно колонизировать слизистые верхних дыхательных путей (ВДП), так и являться причиной серьезных инфекционных заболеваний и осложнений гриппа и ОРВИ у детей, лиц пожилого возраста, беременных, пациентов с хроническими заболеваниями, а также у иммунокомпрометированных пациентов. В «доковидную эру» пневмококк вызывал основную массу случаев внебольничной пневмонии (ВП) [1]. В зависимости от возраста, вакцинального статуса, а также возможных факторов риска S. pneumoniae может являться причиной от 5 до 88% случаев ВП у лиц разного возраста [2–4]. В этиологической структуре ВП определенную роль также играет H. influenzae (10–20% случаев) [5, 6]. Как S. pneumoniae, так и H. influenzae обнаруживают у 70–80% больных острым средним отитом (ОСО) [7, 8]. Кроме этого, пневмококк и гемофильная палочка могут вызывать бактериальные менингиты [9, 10].

Носоглоточное носительство S. pneumoniae и H. influenzae затрудняет этиологическую диагностику инфекционных заболеваний. В разгар сезона ОРВИ пневмококк обнаруживают более чем у 70% здоровых людей, у детей доля носителей может достигать 97% [11]. Гемофильная палочка колонизирует ВДП 20–80% здоровых детей [12, 13].

В последние годы противоэпидемические меры, принимаемые в первый год пандемии COVID-19, способствовали снижению инвазивных инфекций, вызванных S. pneumoniae и H. influenzae [14]. Несмотря на это частота встречаемости пневмококка у здоровых детей младше 5 лет снизилась лишь незначительно [15]. Вместе с тем показано, что колонизация пневмококком у пациентов с COVID-19 ослабляет иммунную защиту организма [16].

В лабораторной практике S. pneumoniae и H. influenzae идентифицируют стандартными бактериологическими методами, чувствительность которых может снижаться в связи с нарушением условий хранения и транспортировки биоматериала, а также проведением антибиотикотерапии. Диагностику также затрудняют особенности культуральных свойств пневмококка и гемофильной палочки. Например, в связи с наличием мутаций некоторые штаммы пневмококка проявляют нехарактерные для них биохимические свойства и, соответственно, могут быть ошибочно идентифицированы как стрептококки группы Viridans [17]. H. haemolyticus часто определяют как нетипируемые штаммы H. influenzae (NTHi). H. haemolyticus редко является причиной ВП, ОСО и менингита, тогда как NTHi могут вызывать эти инфекции, особенно в странах, где посредством вакцинации удалось снизить циркуляцию гемофильной палочки типа b [18]. Показано, например, что пневмококк в крови выявляют менее чем в 5% случаев ВП у детей, а в плевральной жидкости – менее чем в 20% случаев [19]. По данным государственного статистического наблюдения в РФ, пневмококковая этиология ВП подтверждается лишь в 1,3% случаев [20].

Несмотря на повсеместное применение MALDI-ToF (Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight – матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация с время-пролетным разделением) масс-спектрометрии, обеспечивающей быструю идентификацию возбудителя, до сих пор остаются трудности в дифференциации пневмококка и его близкородственных видов. Для повышения специфичности метода в качестве дополнительных прибегают к биохимическим исследованиям [21, 22]. При дифференциации H. influenzae и H. haemolyticus методом MALDI-ToF масс-спектрометрии могут возникнуть сложности в связи со схожестью их белковых профилей [23]. Существенным недостатком этого метода является необходимость получения культуры микроорганизма.

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) – это наиболее быстрый, удобный и доступный метод идентификации микроорганизмов. Показано, что ПЦР-РВ является высокочувствительным и специфичным методом в отношении идентификации ДНК S. pneumoniae и H. influenzae в образцах мокроты [24], плазмы крови [25], бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ) [26] и плевральной жидкости [27]. Кроме этого, возможность разработки количественного формата ПЦР-РВ позволяет оценить концентрацию возбудителя в биологическом материале, тем самым выявляя случаи носительства.

Цель исследования – разработка набора реагентов для количественного определения ДНК S. pneumoniae и H. influenzae методом ПЦР-РВ и валидация его на биологическом материале пациентов с ВП среднего и тяжелого течения, а также сравнение результатов ПЦР и других методов лабораторной диагностики.

Материалы и методы

Были протестированы несеротипированные изоляты и штаммы (тип b) H. influenzae (101) и изоляты S. pneumoniae (181) серотипов 2, 3, ...

Елькина М.А., Яцышина С.Б., Тронза Т.В., Рачина С.А., Спичак Т.В., Акимкин В.Г.