Исследование факторов роста при различных заболеваниях предстательной железы

21.09.2015
591

(1) Кафедра урологии и оперативной нефрологии с курсом онкоурологии медицинского института ФГАОУ ВО РУДН, Москва; (2) Урологическое отделение ГБУЗ ГКБ № 29 ДЗМ, Москва

Проведено изучение биоптатов пациентов с различными болезнями предстательной железы с целью оценки уровней продукции мРНК VEGF и рецепторов к нему KDR, FLT-1, TRF1, MMP-1, MMP-7 и TIMP-2. Внедрение в клиническую урологию результатов анализа уровней продукции VEGF и рецепторов KDR, FLT-1, взаимосвязи металлопротеиназ и их ингибиторов, роли теломерсвязывающего белкового фактора TRIF-1 позволяют расширять возможности верификации и дифференцировки воспалительных, доброкачественных, предраковых и злокачественных новообразований предстательной железы.

Во многих развитых странах мира проблема дифференциальной диагностики болезней предстательной железы остается одной из наиболее актуальных до настоящего времени. Во многом это связано с прогрессивным ростом и широкой распространенностью воспалительных, доброкачественных и злокачественных заболеваний у мужчин как пожилого, так и трудоспособного возраста [1]. Особое внимание при этом уделяется вопросу выявления рака предстательной железы (РПЖ) на ранних стадиях онкопроцесса, который в большинстве случаев развивается на фоне уже имеющейся доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) и хронического простатита (ХП). Следовательно, раннее выявление локализированных форм рака сопряжено с возможностью эффективного лечения [2].

Несмотря на определенную прогностическую значимость ультразвуковых методов исследования, результатов магнито-резонансной томографии и определения фракций простат-специфического антигена в сыворотке крови, у больных РПЖ течение болезни существенно различается [3]. Следовательно, изучение дополнительных биологических характеристик первичной опухоли имеет как важное теоретическое значение для понимания процессов канцерогенеза в предстательной железе, так и практическое значение для прогнозирования течения болезни и улучшения результатов лечения. Не вызывает сомнений, что развитие злокачественной опухоли, в т.ч. и в предстательной железе, процесс мультифакторный, сопряженный с нарушением или перестройкой большей части внутриклеточных механизмов. В связи с этим прогнозирование течения процесса лишь по одному маркеру невозможно [4].

Одна из основных функций теломер заключается в сохранении целостности и стабильности хромосом: теломеры препятствуют нуклеазной деградации хромосомных концов, а также предотвращают их слияние. В клетках человека идентифицирован теломер-связывающий белковый фактор TRF1, способный связываться с теломерными повторами in vitro. Данный белок присоединяется к двухнитевым участкам теломер и препятствует работе фермента теломеразы. Этот фермент отвечает за восстановление теломер, концевых участков хромосом, которые укорачиваются при каждом делении. Активация теломеразы в обычной соматической клетке приводит к стабилизации длины теломер, что в свою очередь ведет к нарушению запрограммированной гибели клеток, которые приобретают возможность неограниченного роста (иммортализация) [5]. Уменьшение количества TRF1 в цитоплазме ведет к постепенному удлинению теломер, поскольку открывается доступ для работы теломеразы [5]. Показана диагностическая значимость TRF1 при разных онкопатологиях, например при раке желудка [6], однако литературные данные по использованию этого маркера в диагностике рака предстательной железы отсутствуют.

Опухолевые клетки в процессе ангиогенеза продуцируют фактор роста эндотелия (VEGF), стимулируют деление и ускоряют формирование капилляров в опухоли [7, 8]. Помимо этого клетки опухолей продуцируют ферменты семейства матрикс-металлопротеиназ (MMP), например MMP-7 (матрилизин), которые разрушают внеклеточный матрикс, упрощая инвазию клеток эндотелия и образование капилляров в опухолевой ткани. Инвазия сосудов в опухоль и способность опухолевых клеток с помощью металлопротеиназ растворять базальные мембраны обеспечивают им проникновение в кровоток и метастазирование в различные органы и ткани [9]. В физиологических условиях и при доброкачественных и воспалительных процессах сохраняется функция биологических механизмов по предотвращению протеолиза тканей, таких как секреция клетками стромы тканевых ингибиторов металлопротеаз (tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP) [10].

В связи с этим целью настоящего исследования явилось определение уровней продукции мРНК VEGF и рецепторов к нему KDR и FLT-1, TRF1, MMP-1, MMP-7 и TIMP-2 в биоптатах предстательной железы пациентов с ДГПЖ, РПЖ, ХП и простатической интраэпителиальной неоплазией (ПИН).

Материал и методы

Факторы роста исследованы у 263 больных. При этом в зависимости от диагноза пациентов разделили на 4 группы. Группа пациентов с ХП состояла из 11 мужчин (средний возраст – 66,1±0,8), группа больных с ДГПЖ из 38 человек (средний возраст – 68,4±1,0), группа пациентов с ДГПЖ+ПИН из 32 пациентов (средний возраст – 68,7±0,9 года), группа больных с верифицированным РПЖ из 58 пациентов (средний возраст – 68,8±1,2 года). Статистически достоверных различий между группами по возрасту выявлено не было (р>0,05).

РНК выделяли методом, предложенным Р. Chomczynski, с некоторыми модификациями [11]. Концентрацию полученных растворов РНК измеряли c помощью спектрофотометра «GeneQuant pro» («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания) по поглощению при длине волны 260 нм.

Для оценки качества выделенной РНК проводили электрофорез образцов (по 1 мкг) в 1,5%-ном агарозном геле. После электрофореза гель окрашивали с помощью красителя SYBRGreen II («Sigma», США): 8 мкл на 40 мл геля с экспозицией 40 минут. Целостность РНК оценивали визуально при облучении геля на ультрафиолетовом трансиллюминаторе по наличию двух субъединиц (28S и 18S) рибосомальной РНК. Уровни продукции мРНК VEGF, KDR, FLT-1, TRIF-1, MMP-1, MMP-7 и TIMP-2 оценивали полуколичественным методом после выполнения совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Обратную транскрипцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, приготовленной на обработанной DEPC деионизированной стерильной воде и содержащей 67 мM Tris-HCl (pH 8,8), 16,6 мM (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20, 4 мM MgCl2, 1 мM каждого дезоксирибонуклеозидфосфата (dNTP), 3,2 мкг гексамерных праймеров со случайной последовательностью, 10 мM дитиотреитола, 10 ЕД ингибитора рибонуклеаз («Fermentas», Литва), 30 ЕД рекомбинантной обратной транскриптазы M-MLV («Sigma», США), 1 мкг РНК. Смесь инкубировали при 42°С в течение часа. Реакцию останавливали путем денатурации обратной транскриптазы, выдерживая смесь при 94°С в течение 10 минут. Полученную кДНК амплифицировали методом ПЦР с использованием специфических праймеров на исследуемые РНК-матрицы. Количество циклов ПЦР подбирали для исследуемых кДНК на основании экспоненциальных кривых выхода ПЦР-продукта.

Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле и 0,1 M TBE буфере. Образцы вносили в лунки геля в объеме 10 мкл. Визуализацию разделенных продуктов проводили на ультрафиолетовом трансиллюминаторе после выдерживания геля в высокочувствительном красителе SYBRGreen I («Sigma, США): 8 мкл на 40 мл геля с экспозицией 40 минут. Гель снимали на цифровую фотокамеру Kodak с выдержкой 1 секунда и проводили анализ изображения на компьютере с помощью программы «ImageJ». Для полуколичественной оценки уровня продукции мРНК VEGF, KDR, FLT-1, TRIF-1, MMP 1-го и 7-го типов, TIMP-2, а также фрагмента β-актина измеряли интенсивность свечения в геле ПЦР-продуктов, после этого определяли отношение интенсивности свечения исследуемого фрагмента к интенсивности свечения фрагмента β-актина.

Пример электрофоретического разделения ПЦР-продуктов фрагментов генов, кодирующих TRF1, MMP-7 и β-актин, представлен на рис. 1. Ген, кодирующий β-актин, является конститутивным и его продукция в клетках осуществляется на определенном постоянном уровне. В связи с этим исследования были направлены на определение отношений уровней продукции мРНК вышеуказанных факторов к уровню продукции мРНК гена, кодирующего β-актин, что позволило понять, при каких заболеваниях простаты и в какой степени меняется уровень продукции исследуемых факторов относительно стандартного показателя продукции конститутивного гена.

Результаты и обсуждение

При оценке относительного уровня продукции VEGF было выявлено отсутствие статистически значимых различий между группами пациентов с ХП, ДГПЖ, ПИН и РПЖ (p>0,05, рис. 2). Так, у пациентов с верифицированным РПЖ средний уровень продукции сосудистого фактора выше в 1,3; в 2,4 и 1,4 раза, чем у больных групп ПИН, ДГПЖ и ХП соответственно. Следовательно, неоангиогенез наблюдается при воспалительных, доброкачественных заболеваниях предстательной железы и РПЖ, но при злокачественной трансформации уровень продукции сосудистого фактора несколько выше.

При оценке показателей уровней продукции соотношения KDR/β-актин выявлено, что у пациентов с верифицированным РПЖ средний уровень указанного фактора в 1,3; 3,3 и 1,2 раза выше, чем у пациентов групп ПИН, ДГПЖ и ХП. Следовательно, пролиферативные процессы наблюдаются при доброкачественных и злокачественных новообразованиях предстательной железы, но при ДГПЖ выражены в меньшей степени. Однако также все эти соотношения признаны статистически не достоверными (p>0,05, рис. 3).

При анализе процессов дифференцировки эндотелиоцитов посредством определения уровней продукции FLT-1/β-актин выявлено, что у больных РПЖ данное соотношение было в 1,3 раза выше, чем у пациентов с ХП.

В то же время уровень продукции FLT-1/β-актин был в 1,8 и 3,9 раза ниже, чем у пациентов групп ПИН и ДГПЖ соответственно. Таким образом, последовательно в группах ДГПЖ–ПИН–РПЖ происходит снижение активности процессов дифференцировки эндотелиоцитов (p>0,05; рис. 4).

При одновременном анализе процессов пролиферации и дифференцировки эндотелиоцитов выявлено, что статистически достоверными признаны различия в средних значениях отношения уровней продукции мРНК KDR/FLT-1 у пациентов с РПЖ, ПИН, ДГПЖ и ХП (p<0,05). Как демонстрирует рис. 5, от группы пациентов с РПЖ к группе пациентов с ХП наблюдается последовательное уменьшение значений уровней продукции KDR/FLT-1. Так, в группе пациентов с РПЖ среднее значение отношения уровней продукции мРНК KDR/FLT-1 в 2, 7 и 23 раза превышает данное значение по сравнению с группами ПИН, ДГПЖ и ХП соответственно.

Последовательное уменьшение значений отношения уровней продукции KDR/FLT-1 от группы РПЖ к группе ХП происходит в связи со снижением активности процессов пролиферации при одновременном усилении процессов дифференцировки. Рост новых сосудов детерминирован балансом между процессами пролиферации процессами дифференцировки. При низком значении соотношения пролиферации к дифференцировке активность неоангиогенеза резко падает, напротив, при высоких значениях соотношения происходит активный запуск неоангиогенеза с формированием новой системы кровоснабжения, дающую возможность роста опухоли за пределы ее первоначальных размеров и возможность метастазирования.

Таким образом, процессы ангиогенеза наблюдаются при воспалительных, доброкачественных и злокачественных заболеваниях предстательной железы. Раздельный анализ уровней продукции сосудистого фактора роста и рецепторов пролиферации и дифференцировки капилляров не позволяет достоверно дифференцировать РПЖ. Определение уровней продукции соотношения KDR/FLT-1 является ценным диагностическим маркером для достоверного отличия всех исследуемых заболеваний предстательной железы (РПЖ, ПИН, ДГПЖ и ХП).

Анализ уровней продукции ММР-1 показал, что у пациентов с ХП данный уровень выше, чем у пациентов РПЖ в 7 раз, и определялся у пациентов группы ДГПЖ и ПИН на низком уровне. Следовательно, у пациентов с ДГПЖ и ПИН продукция MMP-1 резко снижена (p>0,05; рис. 6).

Таким образом, уровень экспрессии ММР-1 ниже у больных РПЖ, ПИН и ДГПЖ по сравнению с пациентами с ХП. Можно предположить, что исследуемый тип металлопротеиназы не играет существенную роль в процессах неоангиогенеза при злокачественных и доброкачественных новообразованиях предстательной железы и встречается при воспалительных процессах в простате.

При анализе чувствительности и специфичности определения продукции ММР-1 выявлено, что данные показатели составили соответственно 18 и 83%.

Исследование уровней продукции TIMP-2 (рис. 7) показало, что у пациентов с верифицированным РПЖ продукция данного фактора в 2,4 раза выше, чем у пациентов с ДГПЖ, в 1,4 выше, чем у пациентов с ПИН, и в 1,5 раза выше, чем у пациентов с ХП. Однако у пациентов групп ХП, ДГПЖ, ПИН и РПЖ не было выявлено достоверного отличия в уровнях продукции исследуемого маркера (p>0,05). Чувствительность и специфичность определения продукции TIMP-2 составили соответственно 54 и 81%. Уровень продукции ингибитора металлопротеиназ TIMP-2 существенно выше у пациентов с верифицированным РПЖ, однако дифференцировать злокачественное новообразование от ДГПЖ и ХП по данному маркеру не представляется возможным.

Анализ уровней продукции MMP-7 (рис. 8) показал, что у пациентов с верифицированным РПЖ продукция данного фактора в 4,2 раза выше, чем у пациентов с ДГПЖ, в 1,3 выше, чем у пациентов с ПИН, и в 1.4 раза ниже, чем у пациентов с ХП. Выявлено достоверное отличие уровней продукции MMP-7 между групп ХП–ДГПЖ и ХП–РПЖ (p<0,05). Между группами ДГПЖ, ПИН и РПЖ не было выявлено достоверного отличия в уровнях продукции исследуемого маркера (p>0,05).

Кроме того, у пациентов с умереннодифференцированным РПЖ продукция ММР-7 в 2 раза выше, чем у больных с высоко- и низкодифференцированным РПЖ (p<0,05; рис. 9).

Чувствительность и специфичность определения продукции ММР-7 составили соответственно 62 и 81%.

Продукция теломерсвязывающего белкового фактора TRF-1 выявлена во всех группах, причем несколько выше у больных ДГПЖ и ХП. Однако статистически значимых отличий между группами пациентов выявлено не было (p>0,05; рис. 10). Анализ уровней продукции TRF1 показал достоверное отличие между пациентами с высокодифференцированным РПЖ и умеренно- и низкодифференцированным РПЖ (p<0,05, рис. 11). Чувствительность и специфичность определения продукции TRF-1 составили соответственно 61 и 84%.

Полученные результаты указывают на диагностическую ценность TRF-1 и MMP-7 в отношении определения степени дифференцировки рака, но не позволяют дифференцировать доброкачественные, злокачественные и воспалительные процессы в предстательной железе. Таким образом, внедрение в клиническую урологию результатов анализа уровней продукции VEGF и рецепторов к нему (KDR, FLT-1), взаимосвязи металлопротеиназ и их ингибиторов, продукции теломерсвязывающего белкового фактора TRIF-1 позволяют расширить возможности верификации и дифференцировки воспалительных, доброкачественных, предраковых и злокачественных заболеваний предстательной железы.

Список литературы

  1. Аполихин О.И., Сивков А.В., Москалева Н.Г., Солнцева Т.В., Комарова В.А. Анализ уронефрологической заболеваемости и смертности в Российской Федерации за десятилетний период (2002–2012 гг.) по данным официальной статистики Экспериментальная и клиническая урология. 2014;2:4–12.
  2. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность) / Под ред. А. Д. Каприна, В. В. Старинского, Г.В. Петровой. М., 2014. С. 10–125.
  3. Алексеев Б.Я., Каприн А.Д., Матвеев В.Б., Носов Д.А., Нюшко К.М., Петровский А.В., Свиридов П.В. Клинические рекомендации по диагностике и лечению больных раком предстательной железы. Общероссийский союз общественных объединений ассоциация онкологов России. 2013. С. 307–608.
  4. Герштейн, Е.С., Кушлинский Н.Е. Факторы роста, их рецепторы и нижележащие сигнальные белки: от эксперимента к клинике. Успехи молекулярной онкологии. 2014;1:27–35.
  5. Глухов А.И., Гордеев С.А., Апрятин С.А., Северин С.Е. Теломераза: клеточное старение, иммортализация и рак. Вестник научно-исследовательского института молекулярной медицины. 2006. Вып. 6.
  6. Yamada M., Tsuji N., Nakamura M., Moriai R., Kobayashi D., Yagihashi A., Watanabe N. Down-regulation of TRF1, TRF2 and TIN2 genes is important to maintain telomeric DNA for gastric cancers. Anticancer Res. 2002;22(6A):3303–07.
  7. Апрятин С.А., Пульбере С.А., Авдошин В.П., Зимник О.В., Гордеев С.А., Глухов А.И. Исследование фактора роста эндотелия сосудов человека и рецепторов к нему как перспективных генетических маркеров диагностики новообразований предстательной железы. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. 2007;3:32–38.
  8. Wey J.S., Fan F., Gray M.J., Bauer T.W., McCarty M.F., Somcio R., Liu W., Evans D.B., Wu Y., Hicklin D.J., Ellis L.M. Vascular endothelial growth factor receptor-1 promotes migration and invasion in pancreatic carcinoma cell lines. Cancer. 2005;104:427–38.
  9. Ii M., Yamamoto H., Adachi Y., Maruyama Y., Shinomura Y. Role of Matrix Metalloproteinase-7 (Matrilysin) in Human Cancer Invasion, Apoptosis, Growth, and Angiogenesis. Exp. Biol. Med. 2006;231:20–27.
  10. Gouyer V., Conti M., Devos P., Zerimech F., Copin M.C., Crеme E., Wurtz, A., Porte H. Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 is an independent predictor of prognosis in patients with non-small cell lung carcinoma who undergo resection with curative intent. Cancer. 2005;103:1676–684.
  11. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. An. Biochem. 1987;162:156–59.

Об авторах / Для корреспонденции

А.А. Костин – д.м.н., проф., кафедра урологии и оперативной нефрологии с курсом онкоурологии медицинского института ФГАОУ ВО РУДН, Москва
М.И. Андрюхин – д.м.н., проф., кафедра урологии и оперативной нефрологии с курсом онкоурологии медицинского института ФГАОУ ВО РУДН, Москва
С.А. Пульбере – к.м.н., кафедра урологии и оперативной нефрологии с курсом онкоурологии медицинского института ФГАОУ ВО РУДН, Москва
П.И. Мотин – зав. урологическим отделением ГБУЗ ГКБ № 29 ДЗМ, Москва
Н.К. Агаев – к.м.н., урологическое отделение ГБУЗ ГКБ № 29 ДЗМ, Москва

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь