STROKE №3 / 2017

Каннабиноидный рецептор 2-го типа активирует нейрогенез ­ и улучшает функциональный исход после инсульта

14 ноября 2017

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina, Instituto de Investigación Hospital 12 de Octubre (i+12), Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Facultad de Ciencias Químicas, Instituto Ramón y Cajal de Investigación Sanitaria (IRYCIS) and Centro de Investigación Biomédica en Red Sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Instituto Universitario de Investigación en Neuroquímica, Universidad Complutense (UCM), Madrid, Spain.

Предпосылки и цель исследования. Инсульт является основной причиной инвалидизации у взрослых, и характеризуется физическими, когнитивными и эмоциональными расстройствами. К сожалению, существует мало методов медикаментозного лечения. Каннабиноидный рецептор 2-го типа (CB2R) оказывает нейропротекторное действие при остром экспериментальном инсульте посредством активации противовоспалительных механизмов. Однако его роль в хроническом инсульте не изучена. Методы. Развитие инсульта у мышей индуцировали с помощью стойкой окклюзии средней мозговой артерии; воздействовали на CB2R путем введения агониста CB2R JWH133 – (6aR, 10aR)-3-(1,1-диметилбутил)-6а,7,10,10а-тетрагидро-6,6,9-триметил-6Н-дибензо[b,d]пирана или антагониста CB2R SR144528 – (N-[(1S)-эндо-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]-гептан-2-ил]-5-(4-хлор-3-метилфенил)-1-(4-метилбензил)-пиразол-3-карбоксамида) один раз в сутки с 3-го дня до окончания эксперимента или путем делеции гена CB2R. Провели анализ меченных иммунофлуоресцентным методом участков головного мозга; проводили окрашивание 5-бром-2’-дезоксиуридином (BrdU), выполняли анализ на клеточном сортере суспензий клеток головного мозга с активацией флуоресценции и проводили поведенческое тестирование. Результаты. Через 14 дней после окклюзии средней мозговой артерии введение SR144528 привело к уменьшению миграции нейробластов к границе зоны инфаркта по сравнению с таковой у мышей, получившими инертное вещество. В соответствии с этим у мышей, получивших этот препарат, как и у мышей с делецией гена CB2R, обнаружили меньшее количество новых нейронов (NeuN+/BrdU+клеток) в периинфарктной зоне через 28 дней от начала инсульта по сравнению с животными, получавшими инертное вещество, и этот эффект сопровождался ухудшением сенсомоторных характеристик при проведении поведенческого тестирования. Агонист CB2R не оказывал влияния на нейрогенез или исход in vivo, но приводил к увеличению миграции нейрональных клеток-предшественников in vitro. Сам по себе антагонист CB2R не влиял на миграцию in vitro. Выводы. Полученные данные подтверждают, что CB2R имеет основополагающее значение в процессе миграции нейробластов и влиянии на тонус эндоканнабиноидной системы, обеспечивает нейрогенез после инсульта, стимулируя миграцию нейробластов к очагу поражения вещества головного мозга, увеличивая число новых кортикальных нейронов и, предположительно, улучшая восстановление двигательных функций после инсульта.

Инсульт является ведущей причиной смерти и инвалидизации во всем мире, ежегодно оказывая влияние ­на миллионы жизней [1]. Тромболизис с применением тканевого активатора плазминогена является единственным одобренным фармакологическим лечением инсульта в остром периоде инсульта [2], и единственной эффективной альтернативой для определенной подгруппы пациентов является внутриартериальная тромбэктомия, что подтверждено результатами нескольких рандомизированных клинических испытаний [3–6]. Несмотря на ограниченные терапевтические возможности, успехи в области профилактики и развития системы здравоохранения привели в последние несколько десятилетий к прогрессирующему снижению уровня смертности ­от инсульта [7]. Прямым следствием этого является большое число лиц, выживших после инсульта, имеющих различные двигательные, когнитивные и психические нарушения. Это подчеркивает необходимость разработки новых методов лечения, способствующих повышению нейропластичности и восстановлению мозга, улучшению функциональных исходов у выживших после инсульта. Важно отметить, что в исследованиях с использованием экспериментальных моделей инсульта показали, что церебральная ишемия способствует пролиферации нейрональных клеток-предшественников (НКП), расположенных в субвентрикулярной зоне (СВЗ), и миграции вновь образованных нейробластов к границе зоны ишемии, где они могут дифференцироваться в зрелые нейроны и замещать погибшие клетки, образовывать новые астроциты с формированием глиального рубца или высвобождать нейротрофические факторы, способствующие восстановлению вещества мозга [9–13]. У взрослых людей нейрогенез является малоактивным процессом [14], и усиление этого эндогенного процесса может служить в качестве терапевтической стратегии для улучшения функциональных исходов у выживших после инсульта. В этом смысле эндоканнабиноидная система может быть перспективным кандидатом, учитывая ­ее четко установленную защитную роль при различной патологии головного мозга [15–19] и данные о ее способности модулировать пролиферацию нейральных стволовых клеток [20, 21], а также миграцию нейробластов ­in vitro и ex vivo [22] в физиологических условиях. Наиболее значимыми каннабиноидными рецепторами являются каннабиноидный рецептор 1-го типа (CB1R), в основном экспрессируемый нейронами [23], и каннабиноидный рецептор 2-го типа (CB2R), главным образом, расположенный на клетках микроглии и, что более интересно, ­в нейрогенных нишах головного мозга в эмбриональном и постнатальном периодах [24–26]. В соответствии с его­ экспрессией, селективная активация CB2R стимулирует пролиферацию нейральных стволовых клеток в культуре и СВЗ у взрослых мышей [27–30]. Однако роль CB2R и механизмы, посредством которых он регулирует нейрогенез в патологических условиях, например при инсульте, пока неизвестны. Поэтому в качестве возможной стратегии лечения инсульта в хроническом периоде цель данного исследования заключалась в определении влияния CB2R на нейрогенез путем изучения процессов пролиферации, миграции и дифференцировки клеток после экспериментального инсульта, вызванного окклюзией дистального сегмента средней мозговой артерии (ОСМА) у мышей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты

Селективный агонист CB2R JWH133 – (6aR,10aR)-3-(1,1-диметилбутил)-6а,7,10,10а-тетрагидро-6,6,9-триметил-6Н-дибензо[b,d]пиран приобрели у компании Tocris Bioscience. Селективный антагонист CBR2 SR144528 (N-[(1S)-эндо-1,3,3-триметилбицикло[2.2.1]-гептан-2-ил]-5-(4-хлор-3-метилфенил)-1-(4-метилбензил)-пиразол-3-карбоксамид) приобрели ­у компании Merck Millipore. JWH133 и SR144528 растворяли в DMSO:Tween:PBS (1:1:18), общий объем раствора, который вводили интраперитонеально каждому животному, составил 200 мкл.

Животные

Эксперименты проводили на самцах мышей C57BL/6 ­в возрасте от 10 до 12 недель, приобретенных в The Jackson Laboratories. Животных содержали в комнате с регулируемой температурой и 12-часовым циклом свет/темнота, при свободном доступе к стандартному корму и воде. ­

Все экспериментальные протоколы придерживались Animal Welfare Committee of the Universidad Complutense (в соответствии с директивами ЕС 86/609/CEE и 2003/65/CE). Проведение экспериментов и отчеты были выполнены согласно стандартам Animal Research: Reporting ­of In Vivo Experiments (ARRIVE). В экспериментах использовали всего 105 мышей. Из исследования не исключили ни одно из животных.

ОСМА у мышей

У мышей инициировали развитие стойкой очаговой церебральной ишемии посредством ОСМА, как было описано ранее [31]. Дополнительная информация представлена в данных on-line.

Динамика изменения очага инфаркта

Динамику изменения очага инфаркта оценивали ­с помощью магнитно-резонансной томографии через ­48 ч после ОСМА или путем окрашивания по Нисслю (0,1% крезилового фиолетового) через 14 и 28 дней. Описание проведенного анализа описано в дополнительных данных on-line.

Обработка тканей и иммунофлуоресценция

У мышей извлекали головно...

И. Браво-Феррер, М.И. Куартеро, Дж.Г. Заррук, Дж.М. Прадилло, О. Хуртадо, В.Г. Ромера, Дж. Диаз-Алонсо, Дж.М. Гарсиа-Сегура, М. Гузман, И. Лизасоаин, И. Галве-Ропер, М.А. Моро
Статья платная, чтобы прочесть ее полностью, вам необходимо произвести покупку
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.