Лейкоцитарная инфильтрация головного мозга после экспериментального внутримозгового кровоизлияния у мышей

Предпосылки и цель исследования. Нейровоспалительные процессы способствуют вторичному повреждению нейронов после внутри-
мозгового кровоизлияния. Цель настоящего исследования заключалась в изучении динамики миграции различных субпопуляций лейкоцитов в головной мозг после инъекции аутологичной крови или коллагеназы в полосатое тело у мышей. Методы. Развитие внутримозгового кровоизлияния у мышей линии C57Bl/6J индуцировали путем инъекции аутологичной крови (20 мкл) или коллагеназы (0,03 ЕД). Оценку объема гематомы проводили с использованием замороженных срезов ткани головного мозга. Объем крови измеряли с помощью спектрофотометрии гемоглобина. Лейкоциты изолировали из полушарий головного мозга через 1, 3, 5 и 14 дней после внутримозгового кровоизлияния, окрашивали с использованием маркеров лейкоцитов и оценивали их число с помощью метода проточной цитометрии. Инъекции гетерологичной крови мышей линии CD45.1 использовали для изучения происхождения лейкоцитов, инфильтрирующих голов-
ной мозг. Результаты. После инъекции коллагеназы объем гематомы был больше, но состав клеток не отличался от состава клеток после инъекции аутологичной крови. Лейкоцитарная инфильтрация головного мозга в полушарии с кровоизлиянием была одинаковой
в обеих моделях. Большинство лейкоцитов, изолированных из головного мозга, были клетками системного кровотока. CD4+ Т-лимфоциты были преобладающей популяцией лейкоцитов в головном мозге в обеих моделях. Тем не менее число гранулоцитов в головном мозге было больше после введения коллагеназы по сравнению с введением крови. Выводы. Инфильтрация головного мозга системными иммунными клетками аналогична в обеих моделях внутримозгового кровоизлияния у мышей. Патофизиологическое воздействие инфильтрации лейкоцитами и, в частности Т-клетками, требует дальнейшего изучения.

На долю внутримозгового кровоизлияния (ВМК) приходится от 10 до 15% от всех инсультов, а смертность и заболеваемость при этой патологии значительно превышает аналогичные показатели при ишемическом инсульте [1, 2]. Отсутствие конкретной цели в терапии ВМК [3] обусловливает потребность в разработке новых методов лечения. Появляется все больше данных, свидетельствующих об участии нейровоспалительных механизмов в развитии повреждения головного мозга и восстановления после ВМК [4–8]. Нейровоспаление включает в себя реакцию клеток, находящихся в головном мозге, а также влияние инфильтрации головного мозга различными системными иммунными клетками. У пациентов с ВМК число лейкоцитов в цереброспинальной жидкости коррелирует с размерами гематомы [9].

Изучение роли лейкоцитарной инфильтрации головного мозга после экспериментального ВМК до сих пор было сосредоточено на врожденном иммунном ответе, в т. ч. инфильтрации нейтрофилами и моноцитами [6, 10–12]. Хотя при ишемии головного мозга были освещены потенциальные защитные и негативные роли различных субпопуляций лимфоцитов [13–17], инфильтрирующим лимфоцитам при ВМК до сих пор уделяли недостаточно внимания [18]. Действительно, кинетику инфильтрации лимфоцитами и другими иммунными клетками, а также и их отдельные патофизиологические роли при ВМК еще предстоит выяснить.

Первоначально после ВМК лейкоциты проникают в головной мозг с кровью из разорвавшегося сосуда. Позже они мигрируют через иммунологический гематоэнцефалический барьер посредством активированной клеточной адгезии [19]. Важным препятствием для лучшего понимания участия системных иммунных клеток в патофизиологии ВМК является ограничение, налагаемое наиболее широко изученными экспериментальными моделями ВМК [20–22]. Инъекция аутологичной крови позволяет изучать токсическое и немедленное воспалительное действие внесосудистых компонентов крови, но не отражает аспекты продолжающегося кровотечения. Напротив, бактериальная коллагеназа растворяет внеклеточный матрикс вокруг капилляров и приводит к активному паренхиматозному кровоизлиянию из-за эрозии сосуда. Тем не менее сосудистый источник кровоизлияния в моделях коллагеназа-индуцированных ВМК отличается от большинства ВМК у людей, при которых кровоизлияние развивается в результате разрыва артерии [23–25]. Важно отметить, что в этих моделях не уточняли точную последовательность инфильтрации головного мозга и патофизиологический вклад различных субпопуляций лейкоцитов, хотя характеристика различий между моделями на животных имеет решающее значение для оценки противовоспалительных терапевтических стратегий при ВМК в будущем.

Цель настоящего исследования заключалась в изучении и сравнении динамики инфильтрации голов-ного мозга различными субпопуляциями лейкоцитов в моделях инъекции аутологичной крови и коллагеназы. Кроме того, в модели инъекции крови мы определили источник инфильтрации головного мозга лейкоцитами на ранней стадии ВМК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

Исследование было проведено в соответствии с национальными стандартами для использования экспериментальных животных. Все экспериментальные процедуры были утверждены правительственным комитетом (Regierungspraesidium Karlsruhe, Германия). В исследовании использовали соответствующих по возрасту 8–10-недельных самцов мышей (линия C57BL/6J; Charles River Laboratories). Для экспериментов с инъекцией гетерологичной крови использовали конгенных CD45.1 мышей на фоне C57BL/6J (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ), которые были любезно предоставлены А. Cerwenka (Немецкий онкологический научно-исследовательский центр). Всех мышей содержали в стандартных условиях цикла 12-часового освещения/темноты и свободного доступа к пище и воде.

Индукция ВМК

Подробное описание моделей инъекции крови и коллагеназы представлено в дополнительных данных on-line.

Оценка размера гематомы

Размер гематомы определяли при изучении замороженных коронарных срезов. После глубокой анестезии посредством внутрибрюшинной инъекции кетамина/ксилазина (100 и 10 мг/кг соответственно) мышам проводили транскардиальную перфузию 15 мл физиологическимраствором. Ткани мозга извлекали и замораживали в изопентане (-20 °C). Замороженные коронарные срезы толщиной 40 мкм разделяли на интервалы 400 мкм и сканировали в 600 точках на дюйм. Размер гематомы анализировали с использованием программного обеспечения ImageJ 1.46 (Национальные институты здравоохранения). Общий объем гематомы (мм3) рассчитывали путем умножения суммы площадей кровоизлияния в каждом замороженном срезе на расстояние между срезами.

Оценка объема крови в пределах полушария с кровоизлиянием

Для оценки не только размера гематомы, но и количества излившейся крови в различных моделях мы провели спектрофотометрию гемоглобина с помощью ранее описанного метода [...

Е. Мракско, Е. Джавиди, С.-И. На, А. Кхан, А. Лиесз, Р. Велткамп