Место ПЦР в лабораторной диагностике вирусных инфекций в рутинной практике

14.09.2017
457

ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Москва, Россия

Лабораторная диагностика актуальна для пациентов с иммунодефицитом. У пациентов с гемобластозами он возникает на фоне основного заболевания и из-за химиотерапии. Последняя может также влиять на патогенез вирусной инфекции.
Цель исследования. Обоснование целесообразности применения метода ПЦР в рутинной диагностике парентеральных вирусных гепатитов и герпесвирусов.
Материал и методы. Определяли лабораторные маркеры герпесвирусов, вирусов гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) в образцах клинического материала 997 пациентов на разных стадиях гемобластозов, протекающих с пневмонией и/или дыхательной недостаточностью и дисфункцией печени (до гепатита).
Результаты. ВГВ-инфекция ассоциирована с низкой (до 10 3МЕ/мл) виремией, ВГС-инфекция – с высокой (более 105 МЕ/мл). Применение ПЦР позволило выявить скрытые формы вирусных гепатитов, ранние стадии инфицирования и предположить вирусассоциированное поражение печени при криптогенном гепатите. ДНК герпесвирусов достоверно чаще выявляются в бронхоальвеолярной лаважной жидкости а не в крови. Поражение органов дыхания часто ассоциировано с герпесвирусами.
Заключение. ПЦР является удобным методом выявления скрытых форм вирусных инфекций у больных гемобластозами. При криптогенном гепатите исследование биоптатов печени позволило предположить вирусассоциированное поражение. Лабораторная диагностика вирусных инфекций должна носить комплексный характер.

Развитие фармацевтической промышленности в последние несколько лет позволило сильно расширить возможности терапии и профилактики вирусных заболеваний [1, 2]. Это связано, в том числе, с разработкой и внедрением новых противовирусных препаратов прямого действия, иммуномодуляторов и вакцин [2]. Однако краеугольным камнем остается своевременная, точная и быстрая лабораторная диагностика. Устойчивое развитие экспериментальной науки способствует расширению спектра используемых методов определения различных микроорганизмов и позволяет перевести некоторые из методик в область рутинной практики диагностических лабораторий [3, 4]. Лабораторная диагностика вирусных инфекций успешно применяет множество методов, которые с учетом детектируемой мишени можно условно разделить на 2 группы [5, 6]. Прямые методы основаны на выявлении компонентов вируса (антигенов, неструктурных белков или нуклеиновой кислоты), опосредованные – на определении реакции организма на присутствие вируса (антитела различных классов). Существует ряд ограничений при использовании тех или иных методов диагностики, связанных как с особенностями патогена, так и с состоянием организма пациента. Наиболее часто используемым и доступным материалом для исследования является кровь. Однако прямые диагностические методы могут быть малоэффективными в случаях, если имеет место локальная репликация вируса, когда зрелые вирионы не попадают в кровоток [7, 8]; элиминация вируса; изменения в структуре компонентов вирионов в результате мутаций [9]; изменение сценария, по которому развивается патогенетический процесс (скрытая форма гепатита В) [10–15]; цитопения или уменьшение числа клеток-мишеней для репликации лимфотропных вирусов [16–22].

Опосредованные методы также имеют ряд ограничений. Например, наличие гипогаммаглобулинемии у пациента может приводить к неэффективной серологической диагностике из-за нарушения синтеза иммуноглобулинов разных классов [18]. С другой стороны, применение внутривенных препаратов иммуноглобулинов, напротив, теоретически может приводить к гипердиагностике. Таким образом, очевидно, что подход к лабораторной диагностике вирусных инфекций должен быть комплексным.

Своевременное выявление вирусной инфекции особенно актуально для пациентов, находящихся в состоянии первичного или вторичного иммунодефицита. К таким пациентам относятся, в первую очередь, ВИЧ-инфицированные, больные онкологического и онкогематологического профиля, реципиенты костного мозга, органов и тканей, и беременные женщины [4, 7, 16–25]. Пациенты с гемобластозами находятся в состоянии иммунодефицита как на фоне течения основного заболевания (угнетения нормального кроветворения), так и за счет проводимой химиотерапии [7, 24]. У них страдают как клеточное, так и гуморальное звено иммунитета, что может приводить к низкому уровню или практически полному отсутствию иммуноглобулинов [24]. Еще одной проблемой лабораторной диагностики является изменение патогенетического процесса вирусной инфекции на фоне массивной цитостатической терапии [8, 10–13, 15].

Суммируя вышесказанное, можно выделить 3 основные причины ложноотрицательных результатов вирусологического исследования у пациентов с угнетенным иммунитетом: низкая репликативная активность вируса; патогенез инфекции на фоне измененного состояния иммунитета; «негативное окно». Также нельзя забывать о влиянии человеческого фактора, который зачастую нивелируется автоматизацией лабораторных процессов. На сегодняшний день опубликовано много работ, описывающих изменения патогенеза инфекций, вызванных вирусами гепатитов В (ВГВ) и С (ВГС) [8, 10–13, 15]. Одно из них характеризуется транзиторным характером выявления различных компонентов вириона или антител к вирусным белкам в кровотоке. Например, стандартный маркер ВГВ – поверхностный антиген (HBsAg) – может периодически не определяться в крови больных хронической формой инфекции даже в фазе обострения [10, 11, 13]. Проблемой является широкое распространение скрытых форм ВГВ и ВГС [10–12, 15].

Выбор метода диагностики в зависимости от ситуации позволяет уменьшить число ложноотрицательных результатов тестирования. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет сократить период «негативного окна»: для ВГВ – до 30 дней от момента инфицирования (HBsAg выявляется на 21 день позже), для ВГС – до 11 дней (антитела к белкам вируса появляются на 42–70 дней позже), для герпесвирусов – до 7–10 дней от момента реактивации (вирусспецифические ДНК определяются в мононуклеарной фракции клеток периферической крови, антитела выявляются на 21–30 дней позже).

Практика гематологического стационара в последние десятилетие показала необходимость увеличения числа используемых лабораторных методов [7, 8, 17, 25]. При подозрении на ВГВ-инфекцию необходимо тестировать кровь пациентов с угнетенным иммунитетом и реципиентов множественных трансфузий не только на HBsA...

Список литературы

1. Rider T.H., Zook C.E., Boettcher T.L., Wick S.T., Pancoast J.S., Zusman B.D. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One 2011; 6(7): e22572.

2. Pawlotsky J.M. New antiviral agents for hepatitis C. F1000 biology reports 2012; 4(5): 557. DOI:10.3410/B4-5

3. Туполева Т.А., Тихомиров Д.С., Грумбкова Л.О., Игнатова Е.Н., Романова Т.Ю., Филатов Ф.П., Гаранжа Т.А. Контаминация при ПЦР-исследованиях: проблемы и решения. Клин. лаб. диагностика 2015; 60(1): 26–42.

4. Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С., Чернова Н.Г., Троицкая В.В., Моисеева Т.Н., Кузьмина Л.А., Филатов Ф.П., Паровичникова Е.Н. Вирусные поражения слизистых оболочек ЖКТ и дыхательных путей у онкогематологических больных. Вестник гематологии 2014; X(4): 17.

5. Storch G.A., Wang D. Diagnostic Virology. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 1: 414–52.

6. Носик Н.Н., Стаханова В.М. Лабораторная диагностика вирусных инфекций. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2000; 2(2): 70–8.

7. Чернова Н.Г., Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Клясова Г.А., Рощина Л.С., Грачева А.Н, Костина И.Э., Аль-Ради Л.С., Моисеева Т.Н., Кравченко С.К. Вирусные поражения слизистых оболочек органов желудочно-кишечного тракта у больных лимфомами. Тер. архив 2014; 86(7): 93–6.

8. Туполева Т.А., Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С., Ярославцева Н.Г., Игнатова Е.Н., Филатов Ф.П. Маркеры вирусной инфекции при заболеваниях системы крови с сопутствующим диагнозом «гепатит неясной этиологии». Справочник заведующего клинико-диагностической лабораторией 2013; (5): 29–33.

9. Pellett P.E., Roizman B. Herpes viridae. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 2: 1802–2080.

10. Zobeiri M. Occult Hepatitis B: Clinical Viewpoint and Management. Hepatitis Research and Treatment 2013; Article ID 259148. http://dx.doi.org/10.1155/2013/259148.

11. Selim H.S., Abou-Donia H.A., Taha H.A., El Azab G.I., Bakry A.F. Role of occult hepatitis B virus in chronic hepatitis C patients with flare of liver enzymes. European Journal of Internal Medicine 2011; 22(2): 187–90. DOI:10.1016/j.ejim.2010.12.001

12. Allain J.P., Mihaljevic I., Gonzalez‐Fraile M.I., Gubbe K., Holm‐Harritshøj L., Garcia J.M. Infectivity of blood products from donors with occult hepatitis B virus infection. Transfusion 2013; 53(7): 1405–15. DOI:10.1111/trf.12096.

13. Tseng T.C., Liu C.J., Yang H.C., Su T.H., Wang C.C., Chen C.L., Fang‐Tzu Kuo S., Liu C.H., Chen P.J., Chen D.S., Kao J.H. Determinants of spontaneous surface antigen loss in hepatitis B e antigen–negative patients with a low viral load. Hepatology 2012; 55(1): 68–76. DOI: 10.1002/hep.24615.

14. Allison R.D., Conry-Cantilena C., Koziol D., Schechterly C., Ness P., Gibble J., Kleiner D.E., Ghany M.G., Alter H.J. A 25-year study of the clinical and histologic outcomes of hepatitis C virus infection and its modes of transmission in a cohort of initially asymptomatic blood donors. Journal of Infectious Diseases 2012; 206(5): 654–61. DOI: 10.1093/infdis/jis410.

15. Carreño V., Bartolomé J., Castillo I., Quiroga J.A. New perspectives in occult hepatitis C virus infection. WJG 2012; 18(23): 2887. DOI: 10.3748/wjg.v18.i23.2887

16. Tikhomirov D., Garanzha T., Troitskaya V.V., Tupoleva T., Romanova T., Galstyan G., Parovichnikova E., Filatov F. Does neutropenia affects herpes virus reactivation in critically ill patients with hematological malignancies and pneumonia? Haematologica 2015; 100(1): 474.

17. Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Троицкая В.В., Галстян Г.М., Паровичникова Е.Н., Филатов Ф.П. Лабораторные маркеры герпесвирусных инфекций при нозокомиальных пневмониях у онкогематологических больных при лейкопении. Вестник гематологии 2014; X(4): 67–8.

18. Булиева Н.Б. Эпидемиология оппортунистических инфекций при гемобластозах. Медицинский альманах 2011; 5(18): 132–7.

19. Hsu J. W., Hiemenz J. W., Wingard J. R., Leather H. Viral Infections in Patients with Hematological Malignancies. Neoplastic Diseases of the Blood 2013; 1193-1–239. DOI: 10.1007/978-1-4614-3764-2_53.

20. Bhanushali M.J., Kranik S.M., Freeman A.F., Cuellar-Rodriguez J.M., Battiwalla M., Gea-Banacloche J.C., Hickstein D.D., Pavletic S., Fahle G., Nath A. Human herpes 6 virus encephalitis complicating allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Neurology 2013; 80(16): 1494–500. http://dx.doi.org/10.1212/WNL.0b013e31828cf8a2

21. Sobh M., Morfin F., Labussiere H., Ducastelle S., Gilis L., Barraco F., Michallet M. Oral Mucositis After Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation: Important Impact Of The Presence Of Aciclovir-Resistant Herpes Simplex Virus (HSV-1) On Its Occurrence. Blood 2013; 122(21): 1048. http://www.bloodjournal.org/content/122/21/1048

22. Ogata M., Satou T., Kadota J. I., Saito N., Yoshida T., Okumura H., Tsudo M. Human herpesvirus-6 reactivation and HHV-6 encephalitis after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a multicenter, prospective study. Clin. Infect. Dis. 2013; 57(5): 671–8. DOI: 10.1093/cid/cit358

23. DiMaio D., Fan H. Viruses, Cell Transformation, and Cancer In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., eds. Fields virology. Philadelphia: Lippincott Williams Wilkins, 2013. Vol. 1: 153–88.

24. Волкова М.А., ред. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей. М.: Медицина, 2008.

25. Туполева Т.А., Игнатова Е.Н., Тихомиров Д.С., Гаранжа Т.А., Ярославцева Н.Г., Гуляева А.А., Грумбкова Л.О., Филатов Ф.П., Молекулярные методы диагностики – удобный инструмент для выявления скрытых вирусных инфекций у доноров крови. Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. М., 2014; 1: 441.

Об авторах / Для корреспонденции

Для корреспонденции:
Тихомиров Дмитрий Сергеевич – к.б.н., старший научный сотрудник научной лаборатории вирусной безопасности трансфузий крови и её компонентов ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России
Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4
Телефон: +7(495) 613-24-23
E-mail: tihomirovgnc@bk.ru
Сведения об авторах:
Романова Тамара Юрьевна – научный сотрудник ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; e-mail: rybnaia@mail.ru
Игнатова Елена Николаевна – научный сотрудник ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; e-mail: ihele@yandex.ru
Ярославцева Наталия Гургеновна – к.б.н., старший научный сотрудник ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; e-mail: ngyar@yandex.ru
Туполева Татьяна Алексеевна – к.м.н., врач-вирусолог, заведующая научно-клиническим отделом вирусологической диагностики ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; e-mail: ttupoleva@mail.ru; tupoleva.t@blood.ru
Гапонова Татьяна Владимировна – к.м.н., заместитель Генерального директора по трансфузиологии ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России; e-mail: gaponova.tatj@yandex.ru; gaponova.t@blood.ru

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 1

Оксана Алексеевна
Но какой предоставили доступ!? Смешно, деньги выкачивание! Ни одной статьи полностью невозможно прочитать! Берите деньги с чиновников, руководителей воров!
Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь