МикроРНК-424 защищает головной мозг мышей от фокальной церебральной ишемии и реперфузионного повреждения путем подавления оксидантного стресса

Предпосылки и цель исследования. В ранее проведенном исследовании мы продемонстрировали, что микроРНК-424 защищает головной мозг мышей от хронического ишемического повреждения посредством активации микроглии. В настоящем исследовании изучали роль микроРНК-424 при транзиторной церебральной ишемии у мышей, уделяя особое внимание повреждению нейронов, индуцированному оксидантным стрессом. Методы. У мышей линии С57/BL6 индуцировали развитие транзиторной церебральной ишемии путем окклюзии средней мозговой артерии в течение 1 часа с последующей реперфузией (ишемия/реперфузия). Количественно оценили содержание микроРНК-424 в кортикальной периинфарктной ткани головного мозга. Мышам также вводили ангомир микроРНК-424 путем интрацеребровентрикулярной инъекции. Проводили оценку объема инфаркта мозга, апоптоза нейронов и содержания маркеров оксидантного стресса и антиоксидантов. В качестве эксперимента in vitro первичные нейроны коры подвергли воздействию H2O2, а затем обработали ангомиром микроРНК-424, киРНК ядерного фактора эритроид 2-связанного с фактором 2 и ингибитором супероксиддисмутазы (СОД); затем изучили активность клеток, высвобождение лактатдегидрогеназы, содержание малонового диальдегида и активность марганец-содержащей супероксиддисмутазы (Mn-СОД). Результаты. Содержание МикроРНК-424 в периинфарктной коре было повышено через 1 и 4 часа, а затем снизилось через 24 часа после реперфузии. Введение микроРНК-424 привело к уменьшению объема очага ишемии и подавлению апоптоза нейронов после ишемии/реперфузии, уменьшению образования активных форм кислорода и содержания малонового диальдегида в ткани коры, и повышению экспрессии и активации Mn-СОД, а также экспрессии внеклеточной СОД и редокс-чувствительного фактора транскрипции ядерного фактора эритроид 2-связанного с фактором 2. В культурах нейронов под воздействием микроРНК-424 произошло уменьшение H2O2-индуцированного повреждения, о чем свидетельствовало уменьшение высвобождения лактатдегидрогеназы и содержания малонового диальдегида и увеличение жизнеспособности клеток и активности Mn-СОД; протекторное влияние микроРНК-424 в отношении оксидантного стресса изменялось в противоположном направлении при нокдауне гена ядерного фактора эритроид 2-связанного с фактором 2 и введением ингибитора СОД. Выводы. МикроРНК-424 защищает от транзиторного повреждения головного мозга при ишемии/реперфузии путем подавления оксидантного стресса.

Ишемический инсульт, возникающий в результате нарушения кровоснабжения головного мозга, является одной из ведущих причин смерти и инвалидности в мире. При этом состоянии необходимо восстановить кровоток, что в свою очередь может привести к развитию реперфузионного повреждения. Оксидантный стресс считается основным событием во время этого процесса [1], поскольку реперфузия стимулирует избыточное образование активных форм кислорода (АФК), таких как перекись водорода (Н2О2), что приводит к окислению белков, липидов и ДНК и может индуцировать клеточную пролиферацию, прекращение роста, апоптоз и некроз [2]. Между тем дисфункция супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы может поставить под угрозу эндогенные механизмы антиоксидантной защиты и усугубить оксидантный стресс и ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение [3, 4]. Ядерный фактор эритроид 2-связанный с фактором 2 (Nrf2) активирует транскрипцию генов антиоксидантного стресса, и образованные вещества согласованно удаляют АФК посредством последовательных ферментативных реакций [5]. В некоторых исследованиях раскрыли потенциал Nrf2-опосредованной транскрипции в отношении защиты от нейродегенерации в результате механизмов, связанных с оксидантным стрессом.

По этой причине Nrf2 считается ценной терапевтической мишенью при повреждении головного мозга свободными радикалами после ишемии и реперфузии.

МикроРНК являются мелкими (≈22 нт) некодирующими одноцепочечными молекулами РНК, которые регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне путем ингибирования трансляции или путем расщепления РНК-транскриптов в определенной последовательности [6]. МикроРНК-424 является опухолевым маркером, который участвует в пролиферации, миграции и инвазии раковых клеток с известной ролью в регуляции клеточного цикла [7, 8]. Она также способствует дифференцировке монобластных клеток [9, 10], модулирует фенотип клеток сосудистого эндотелия и гладкой мускулатуры, ангиогенез [11, 12] и повышает легочное давление в экспериментальных моделях [13]. Относительно цереброваскулярной патологии, в ряде исследований продемонстрировали, что содержание микроРНК-424 в крови и ткани головного мозга снижается у пациентов с ишемическим инсультом и у животных в моделях инсульта [14, 15]. В недавно проведенном исследовании нами было показано, что микроРНК-424 оказывает нейропротекторное действие в модели хронической церебральной ишемии, подавляя активацию микроглии посредст-вом трансляционной супрессии основных активаторов G1/S фазового перехода [15]. Однако ее влияние на церебральную И/Р остается неизвестным, и в настоящее время не существует прямых доказательств влияния микроРНК-424 на повреждение нейронов в условиях оксидантного стресса. В соответствии с рекомендациями Stroke Therapy Academic Industry Roundtable по проведению доклинических исследований при инсульте, сначала следует изучать модели со стойкой окклюзией, а затем модели с транзиторной окклюзией [16]. Поэтому в настоящем исследовании исследовали роль микроРНК-424 при транзиторном И/Р повреждении головного мозга у мышей, механизмы нейропротекции, а также потенциал протекторного действия микроРНК-424 в отношении нейронов в условиях оксидантного стресса посредством Nrf2-независимого пути.

МЕТОДЫ

Модель очаговой церебральной ишемии/реперфузии у мышей

Эксперименты на животных были проведены в соответствии со стандартами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Столичным медицинским университетом. Самцов мышей линии C57BL/6J массой от 22 до 25 г приобрели в Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd (Пекин, Китай). После интравентрикулярной инъекции ангомира микроРНК-424 или контрольного раствора выполняли окклюзию средней мозговой артерии (ОСМА) [17] для индуцирования ишемии. Через 1 час добивались реперфузии. Региональный церебральный кровоток контролировали с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (PeriFlux System 5000; Perimed, Ярфалла, Швеция) для подтверждения развития ишемии (региональный церебральный кровоток <80% от исходного) и реперфузии (региональный церебральный кровоток >70% от исходного). Во время операции поддерживали температуру тела на уровне 37,0±0,5°С с использованием электрогрелки с регулируемой температурой (СМА 150; Carnegie Medicin, Стокгольм, Швеция). Объем очага ишемии измеряли с помощью окрашивания срезов головного мозга 2,3,5-трифенилтетразолинхлоридом (1,5% раствор) через 24 часа после реперфузии. Методы выделения и изоляции ядра ишемии и тканей периинфарктной зоны были описаны ранее [18]. Животных случайным образом разделили на 5 групп: псевдовмешательство (n=15), ишемия/реперфузия через 1 час (И/Р 1 час, n=3), ишемия/реперфузия через 4 часа (И/Р 4 часа; n=3), ишемия/реперфузия через 24 часа (И/Р 24 часа; n=25) и ишемия/реперфузия через 24 часа+введение ангомира микроРНК-424 (И/Р+микроРНК-424; n=22).

Интрацеребровентрикулярное введение ангомира микроРНК-424

Ангомир микроРНК-424 и отрицательный контроль приобрели в GenePharma...

П. Лиу, Г. Зао, Р. Ванг, П. Ванг, З. Тао, Л. Гао, Ф. Ян, К. Лиу, С. Йу, К. Джи, И. Луо