Мультиплексная ПЦР для дифференциации штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль-Тор с различной эпидемической значимостью

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/epidem.2018.4.49-55

26.11.2018
29

ФКУЗ Российский научно-исследовательский институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов, Россия

Цель исследования. Разработка способа одновременной идентификации токсигенных эпидемически опасных штаммов V. cholerae биовара Эль-Тор и дифференциации нетоксигенных штаммов на потенциально эпидемически опасные и эпидемически безопасные.
Материалы и методы. Было использовано 167 штаммов V. cholerae О1 биовара Эль-Тор, 6 нетоксигенных штаммов V. cholerae non O1/O139, 5 штаммов бактерий близкородственных видов рода Vibrio и 3 штамма энтеробактерий.
Результаты. Мультиплексную ПЦР на выявление маркерных генов проводили в один прием в 2 реакционных смесях. Для токсигенных эпидемически опасных штаммов характерно образование 4 амплифицированных фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514, ctxA и tcpA; для нетоксигенных штаммов, потенциально эпидемически опасных – 3 фрагментов, соответствующих генам vc0180, vc0514 и tcpA, а для нетоксигенных эпидемически безопасных – 1 фрагмента, соответствующего гену tcpA, или отсутствие всех детектируемых маркерных генов соответственно.
Заключение. Разработан способ дифференциации штаммов V. cholerae О1 биовара Эль-Тор с различной эпидемической значимостью. Показана специфичность и эффективность разработанной мультиплексной ПЦР, которая может быть использована при проведении эпидемиологических расследований, мониторинговых исследований объектов окружающей среды и для паспортизации штаммов V. cholerae.

Холера – острая диарейная особо опасная инфекция, возбудителем которой является бактерия Vibrio cholerae, продолжает оставаться актуальной проблемой здравоохранения в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки, где периодически возникают эпидемии и вспышки этого заболевания. В связи с увеличением миграции населения существует высокая вероятность завоза холеры на неэндемичные территории, включая Российскую Федерацию [1–3]. Возбудителем текущей, седьмой пандемии холеры является V. cholerae биовара Эль-Тор. За развитие основного клинического симптома при холере (водянистой диареи) ответственны гены ctxAB в составе профага СТХφ, кодирующие холерный токсин. Кластер генов tcpA-F, входящий в состав острова патогенности VPI-1, связан с биосинтезом токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТСР), обеспечивающих колонизацию тонкого кишечника человека холерными вибрионами. Эти 2 фактора патогенности необходимы для развития инфекционного процесса при холере, поэтому штаммы, в геноме которых присутствуют гены ctxA и tcpA, являются эпидемически опасными. Кроме этого, такие штаммы в своем геноме имеют 2 острова пандемичности – VSP-I и VSP-II с генами, необходимыми для адаптации к стрессовым условиям окружающей среды [4, 5].

На территории Российской Федерации при мониторинге водной среды нередко выделяют нетоксигенные штаммы V. cholerae биовара Эль-Тор, не имеющие в своем геноме основных детерминант патогенности (ctxAB−tcpA–). Но время от времени из водной среды, а также от людей выделяются нетоксигенные штаммы холерных вибрионов с неполным набором генов патогенности. Особое значение имеют штаммы, сохранившие в своем геноме гены ТСР (tcpA)1 [6]. Такие штаммы сохраняют способность колонизировать кишечник, что может обусловливать появление вибриононосителей, а также за счет фаговой конверсии способствовать возникновению токсигенной популяции [7, 8]. В связи с этим штаммы холерных вибрионов с генотипом ctxAB−tcpA+ некоторые авторы считают потенциально опасными [9–11]. Впервые об изолятах V. cholerae с генотипом ctxA–tcpA+ сообщили S.M. Faruque и соавт. в 1998 г. [12]. Считалось, что все они представляют потенциальную эпидемическую опасность, так как пили TCP являются рецептором для фага CTXφ. Согласно гипотезе авторов, нетоксигенные штаммы холерных вибрионов с генотипом ctxA–tcpA+, находящиеся в объектах окружающей среды, при попадании в кишечник человека могут быть инфицированы CTXφ-фагом, образовывать токсигенные клоны и в дальнейшем приводить к эпидемическим вспышкам. Образование новых эпидемически опасных клонов определяется условиями как организма человека, так и окружающей среды. Однако в ряде публикаций было указано, что TCP-зависимая передача фага CTXφ между вибрионами происходит преимущественно в условиях in vivo, так как пили TCP V. cholerae биовара Эль-Тор в большей степени образуются в организме хозяина [8, 12, 13]. Для успешного формирования токсигенных клонов из нетоксигенных необходимо одновременное попадание в кишечник как нетоксигенных штаммов с генотипом ctxA–tcpA+, так и фага CTXφ. Такое развитие событий возможно на эндемичных по холере территориях, где открытые водоемы часто контаминируются токсигенными штаммами. На территории Российской Федерации, которая является неэндмичной территорией, в последнее время регистрировали только завозные случаи холеры, обусловленные токсигенными штаммами, а выделение токсигенных штаммов холерных вибрионов из объектов окружающей среды носило единичный характер. Поэтому вероятность одновременного поп...

Список литературы

1. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Федоров Ю.М., Подосинникова Л.С., Горобец А.В. Холера в начале XXI века. Прогноз. Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол 2005; (3): 44–8.

2. Титова С.В., Москвитина Э.А., Кругликов В.Д., Самородова А.В., Тюленева Е.Г., Монахова Е.В., Писанов Р.В., Водопьянов А.С., Архангельская И.В., Иванова С.М., Ковалева Т.В., Водопьянов С.О. Холера: Оценка эпидемиологической обстановки в мире и России в 2006–2015 гг. Прогноз на 2016 г. Проблемы особо опасных инфекций 2016; (1): 20–7. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-1-20-27

3. Dziejman M., Balon E., Boyd D., Fraser C.M., Heidelberg J.F., Mekalanos J.J. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease. Proc. Nat. Acad. Sci. 2002; 99(3): 1556–61. DOI: 10.1073/pnas.042667999

4. O’shea Y. A., Reen F.J., Quirke A.M., Boyd E.F. Evolutionary genetic analysis of the emergence of epidemic Vibrio cholerae isolates on the basis of comparative nucleotide sequence analysis and multilocus virulence gene profiles. J. Clin. Microbiol 2004; 42(10): 4657–71. DOI:10.1128/JCM.42.10.4657-4671.2004.

5. Waldor M.K., Makalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous bacteriophage encoding cholera toxin. Science 1996; 272(5270): 5819–25. DOI: 10.1126/science272.5270.1910

6. Осина Н.А., Каляева Т.Б., Бугоркова Т.В., Касьян И.А.. Обороткина Н.Ф. Результаты мониторинга холерных вибрионов в водных экосистемах на территории Республики Калмыкия. Здоровье населения и среда обитания 2013; 2(239): 28–30.

7. Титова С.В., Монахова Е.В. О потенциальной опасности нетоксигенных штаммов холерных вибрионов, содержащих гены токсин-корегулируемых пилей адгезии. Эпидемиол. инфекц. болезни. Актуал. вопр. 2016; (5): 65–70.

8. Faruque S.M., Mekalanos J.J. Phage-bacterial interactions in the evolution of toxigenic Vibrio cholerae. Virulence 2012; 3(7): 556–65. DOI: 10.4161/viru.22351

9. Гриднева Л.Г., Мусатов Ю.С., Громова Т.В., Пуховская Н.М., Белозерова Н.Б., Уткина О.М., Иванов Л.И., Ковальский А.Г., Миронова Л.В., Куликалова Е.С., Хунхеева Ж.Ю., Балахонов С.В. Результаты мониторинга и биологические свойства холерных вибрионов, изолированных из объектов окружающей среды на территории Хабаровского края. Проблемы особо опасных инфекций 2014; (1): 121–4.

10. Миронова Л.В., Хунхеева Ж.Ю., Пономарева А.С., Басов Е.А., Гольдапель Э.Г., Урбанович Л.Я., Громова Т.В., Краснощеков В.Н., Борзов В.П., Алленов А.В., Ковальский А.Г., Балахонов С.В. Молекулярно-эпидемиологический анализ ситуации по холере на Дальнем Востоке России в период седьмой пандемии. Дальневосточный журнал инфекционной патологии 2015; 27: 57–62.

11. Титова С.В., Кругликов В.Д., Ежова М.И., Водопьянов А.С., Архангельская И.В., Водопьянов С.О., Москвитина Э.А. Анализ динамики выделения и биологических свойств штаммов V. cholerae О1 El-Tor, изолированных из водных объектов на территории Ростовской области в 2003–2014 гг. Здоровье населения и среда обитания 2015; (2): 39–41.

12. Faruque S.M., Asadulghani, Saha M.N., Alim Abdul A.R.M., Albert John M., Nasirul Islam K.M., Mekalanos J.J. Analysis of clinical and environmental strains of nontoxigenic Vibrio cholerae for susceptibility to CTXφ: molecular basis for origination of new strains with epidemic potential. Infect. Immun. 1998; 66(12): 5819–25.

13. Krebs S.J., Taylor R.K. Protection and attachment of Vibrio cholerae mediated by the toxin-coregulated pilus in the infant mouse model. J. Bacteriol 2011; 193(19): 5260–70. DOI: 10.1128/JB.00378-11

14. Смирнова Н.И., Кульшань Т.А., Баранихина Е.Ю., Краснов Я.М., Агафонов Д.А., Кутырев В.В. Структура генома и происхождение нетоксигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор с различной эпидемиологической значимостью. Генетика 2016; 52(9): 1029–41. DOI: 10.7868/S0016675816060126

15. Смирнова Н.И., Челдышова Н.Б., Костромитина Е.А., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов Эль-Тор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции. Журн. эпидемиол., микробиол. и иммунобиол. 2001; 6: 11–16.

16. Плеханов Н.А., Заднова С.П., Агафонов Д.А., Смирнова Н.И. Конструирование мультиплексной ПЦР для идентификации токсигенных штаммов генетических вариантов Vibrio cholerae Эль-Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу. Биотехнология 2015; (2): 82–90.

17. Кульшань Т.А., Топорков А.В., Смирнова Н.И. Генетические изменения вирулентных штаммов холерных вибрионов биовара Эль-Тор при их обитании в водной среде. Проблемы особо опасных инфекций 2006; 91: 41–4.

Для цитирования: Агафонова Е.Ю., Агафонов Д.А., Смирнова Н.И. Мультиплексная ПЦР для дифференциации штаммов Vibrio cholerae О1 биовара Эль-Тор с различной эпидемической значимостью. Эпидемиол. инфекц. болезни. Актуал. вопр. 2018; (4):49–55

Об авторах / Для корреспонденции

Агафонова Елена Юрьевна – младший научный сотрудник отдела микробиологии ФКУЗ Российский научно-исследовательский институт «Микроб» Роспотребнадзора; е–mail: elenabaranichina@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9988-6312
Агафонов Дмитрий Алексеевич – к.б.н., старший научный сотрудник отдела микробиологии ФКУЗ Российский научно-исследовательский институт «Микроб» Роспотребнадзора; e-mail: rusrapi@microbe.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9273-6063
Смирнова Нина Ивановна – д.б.н., профессор, заведующая отделом микробиологии ФКУЗ Российский научно-исследовательский институт «Микроб» Роспотребнадзора; e-mail: rusrapi@microbe.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7115-6286

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь

Статьи по теме

Все издания

Смотрите также