STROKE №4 / 2011
NCX1 — новый ген-мишень для гипоксия-индуцируемого фактора-1 при ишемическом прекондиционировании головного мозга
Предпосылки и цель исследования. Белок натрий-кальциевый транспортер-1 (NCX1) является ключевым медиатором для поддержания
[Na+]i и [Ca2+]i гомеостаза. Хотя во время инсульта происходят изменения содержания белка NCX1 и экспрессии его транскрипта, механизмы регуляции транскрипции до сих пор не известны. Однако в настоящее время существуют доказательства того, что гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) является ядерным фактором, необходимым для активации транскрипции нескольких генов, причастных к развитию инсульта. Основной целью данного исследования было изучение гена NCX1 в качестве новой мишени для HIF-1 в головном мозге.
Методы и результаты. Согласно результатам нашего исследования, можно привести следующие данные: (1) в результате сайленсинга HIF-1 удалось предотвратить повышенную экспрессию NCX1 после кислородо-глюкозной депривации или кобальт-индуцированной HIF-1 активации в нервных клетках; (2) промотор NCX1 головного мозга, клонированный с 5' от гена люциферазы светлячка, содержал 2 участка генов-мишеней HIF-1, называемых гипоксия-зависимыми элементами, которые чувствительны к кислородо-глюкозной депривации или хлориду кобальта; (3) HIF-1 специфически связывает гипоксия-зависимые элементы на NCX1 головного мозга, о чем свидетельствует сдвиг полос и результаты анализов иммунопреципитации хроматина; (4) сайленсинг HIF-1α позволяет предотвратить повышение экспрессии NCX1 и нейропротекции, индуцированной ишемическим прекондиционированием; (5) сайленсинг NCX1 привел к регрессу индуцированной прекондиционированием нейропротекции у крыс. Выводы. Ген NCX1 является новой мишенью для HIF-1, который играет роль в сохранении жизнедеятельности клеток путем повышения экспрессии NCX1 во время прекондиционирования головного мозга.
Гипоксия-индуцируемый фактор-1 (HIF-1) является ядерным фактором, необходимым для активации транскрипции в ответ на гипоксию [1], который регулирует несколько генов, участвующих в эритропоэзе, обмене железа, ангиогенезе и метаболизме глюкозы [2]. При ишемии головного мозга [3, 4], повторяющихся эпизодах гипоксии-реоксигенации [5] или ишемическом прекондиционировании [6, 7] у крыс повышается экспрессия этого транскрипционного фактора в головном мозге. Примечательно, что среди генов, экспрессия которых изменяется во время ишемии головного мозга, наибольший интерес представляет белок натрий-кальциевый транспортер-1 (NCX1), убиквитарный протеин клеточной мембраны, который регулирует клеточный гомеостаз кальция и натрия в головном мозге [8]. До настоящего времени только в нескольких исследованиях особое внимание уделяли регуляции экспрессии NCX1 в головном мозге на уровне транскрипции.
Таким образом, чтобы разобраться в механизмах, участвующих в регуляции экспрессии NCX1 на уровне транскрипции, мы изучали ген NCX1 в качестве мишени для транскрипционного фактора HIF-1 в головном мозге. С этой целью мы изучили мРНК NCX1 и экспрессию белка в нервных клетках с сайленсингом HIF-1 после кислородо-глюкозной депривации (КГД) или воздействия хлорида кобальта (CoCl2), т.е. в двух экспериментальных условиях, приводящих к активации HIF-1. Затем выявили наличие гипоксиязависимых элементов (HRE), чувствительных к КГД или CoCl2 на промоторе NCX1 головного мозга. Вслед за этим установили специфическое связывание HIF-1 с HRE на промоторе NCX1 головного мозга. Наконец выяснили, оказывает ли избыточная экспрессия NCX1, индуцированная HIF-1 в головном мозге, нейропротективное действие при ишемическом прекондиционировании в модели на животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Все рестрикционные эндонуклеазы и модифицирующие ДНК ферменты были приобретены в New England Biolabs или Invitrogen. Наборы генов-репортеров люциферазы и векторы приобрели в Promega. Синтетические олигонуклеотиды были предоставлены Primm. Среду Игла, модифицированную Дульбекко, и эмбриональную телячью сыворотку приобрели в Invitrogen. Малые интерферирующие двухцепочечные РНК олигонуклеотиды (миРНК) к человеческому HIF-1 (GenBank регистрационный номер NM_181054) были предоставлены Dharmacon. МиРНК к HIF-1α крыс (GenBank регистрационный номер NM_024359) и NCX1 крыс (GenBank регистрационный номер NM_019268) приобрели в Qiagen. Все известные реагенты самого высокого качества были приобретены в Sigma-Aldrich.
КГД
Препараты нейронов гиппокампа изготовили из тканей мозга 18-дневных эмбрионов крыс линии Wistar (Charles River, Calco, Милан, Италия), как описано ранее [9], и использовали в течение 10 дней. Нейроны культивировали в модифицированной среде Игла/F12, содержащей 30% глюкозы, 5% деактивированной эмбриональной телячьей сыворотки и 5% лошадиной сыворотки, L-глутамин (2 ммоль/л), пенициллин (50 ед/мл) и стрептомицин (50 мкг/мл). Нейробластомные SH-SY5Y клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с до бавлением 10% инактивированной на гре ванием эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллина (100 ЕД/мл), стрептомицина (100 мкг/мл), заменимой аминокислоты (0,1 ммоль/л) и L-глутамина (2 ммоль/л) – все из Invitrogen. SH-SY5Y клетки, дифференцированные с использованием 10 мкмоль/л ретиноевой кислоты в течение 48 часов, и нейроны гиппокампа подвергли КГД в течение 3 и 2 часов соответственно [9].
Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия
Описание процедур двойного иммуннофлуоресцентного окрашивания нейронов гиппокампа и SH-SY5Y клеток было представлено ранее [10]. Первичные антисыворотки против NCX1 (моноклональные антитела мыши, 1:400; Swant) или против HIF-1α (поликлональные антитела кролика, 1:3000; Novus Biologicals) инкубировали при 4 °С в течение ночи. Флуоресцентно-меченые вторичные антитела, Alexa 488-конъюгированный антимышиный иммуноглобулин G и Alexa 594-конъюгированный антикроличий иммуноглобулин G (каждый в разведении 1:200; Molecular Probes) инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунофлуоресценцию изучали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 510 META (Carl Zeiss).
Анализ полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой
Все РНК экстрагировали с помощью тризола в соответствии с инструкцией поставщика реагента (Invitrogen). Первую цепь кДНК синтезировали из 5 мкг общей РНК с использованием системы первой цепи SuperScript для полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскриптазой. Полуколичественную ПЦР проводили при следующих условиях: 95 °С в течение 3 часов, 30 или 35 циклов реакции (95 °С в течение 1 часа, 48 °С в течение 1 часа, 72 °С в течение 1 часа) и 72 °C в течение 10 часов. Использовали следующие пары нуклеотидов: 5’-ACCACCAAGACTACAGTGCG-3’ и 5’-TTGGAAGCTGGTCTGTCTCC-3’ для NCX1 [11] и 5’-CCTGCTGGATTACATTAAAGCACTG-3’ и 5’-CCTGAAGTACTCATTATAGTCAAG-3’ для ге на гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы [12]. Продукты ПЦР анализировали с...
