Клиническая Нефрология №1 / 2016
Опыт использования высокопроизводительного параллельного секвенирования ДНК для характеристики молекулярно-генетических особенностей ангиомиолипом почки
1 ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, Москва; 2 ФБГНУ «Медико-генетический научный центр», Москва; 3 ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» МЗ РФ, НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, Москва; 4 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» МЗ РФ, Москва
Ангиомиолипома – одна из наиболее типичных форм патологии почек при туберозном склерозе. Поскольку туберозный склероз как генетическое заболевание ассоциирован с мутациями в генах TSC1 и TSC2, мутационное профилирование ангиомиолипом до сих пор также ограничивалось лишь этими двумя генами. Нами впервые проведен скрининг мутаций широкой панели генов, вовлеченных в опухолеобразование, в операционном материале и крови больных ангиомиолипомой методом высокопроизводительного параллельного секвенирования. Секвенирование ДНК опухолевых образцов выявило мутации в общей сложности в 30 из 409 исследованных генов. Выявлены мутации гена TSC2 как герминативной, так и соматической природы. Помимо TSC2 наибольшее количество нуклеотидных замен в ДНК опухолей обнаружено в гене ROS1. Интересно, что все обследованные нами пациентки являются носительницами полиморфизма в гене CYP2D6 (c.G1094A:p.R365H), частота встречаемости которого в общей популяции не превышает 10%. Дальнейший поиск и характеристика мутаций в расширенной выборке больных внесут вклад в изучение биологии ангиомиолипомы почки и обеспечат основу для разработки новых способов профилактики и лечения этого заболевания.
Введение
Ангиомиолипома – одна из наиболее типичных форм патологии почек при туберозном склерозе [1]. Туберозный склероз – генетически детерминированное заболевание, причиной которого являются мутации в генах супрессоров опухолевого роста TSC1 и TSC2. Мутации гена TSC2, по данным Каталога соматических мутаций в опухолях (Catalogue of Somatic Mutations in Tumors – COSMIC), выявляются в материале ангиомиолипом почки примерно в половине случаев [2].
Подавляющее большинство типов опухолей человека к настоящему времени достаточно подробно охарактеризовано с точки зрения спектра соматических мутаций, чего нельзя сказать о ангиомиолипомах почки, исследования мутационного профиля которых за пределами генов TSC1 и TSC2 практически не проводились.
Высокопроизводительное параллельное секвенирование ДНК – новый метод молекулярно-генетического анализа, позволяющий проводить одновременный поиск мутаций в значительном количестве генов. Мы впервые применили этот метод для поиска мутаций в опухолевом материале и лимфоцитах периферической крови больных ангиомиолипомой почки.
Материал и методы
В исследование включены 6 пациенток с ангиомиолипомой почки, которые проходили лечение в клинике урологии им. И.М. Сеченова. Возраст больных варьировался от 23 до 64 лет (средний возраст – 43,5 года), размер образования – от 37 до 77 мм (средний размер – 55,8 мм).
В пяти случаях проведено экзомное секвенирование ДНК из операционного материала опухолей, в одном случае – экзомное секвенирование ДНК из лимфоцитов периферической крови, поскольку операция не проводилась.
Скрининг мутаций в генах, вовлеченных в канцерогенез, проведен методом секвенирования нового поколения на платформе Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Протокол включает этапы подготовки библиотек фрагментов геномной ДНК, клональной эмульсионной ПЦР, секвенирования на геномном анализаторе и биоинформационного анализа результатов. Библиотеки фрагментов ДНК готовили, используя технологию Ion Ampliseq, представляющую собой ультрамультиплексную ПЦР (до 4000 пар праймеров в одной пробирке). Для проведения скрининга мутаций отобраны гены с наибольшими показателями частоты соматических мутаций в опухолях человека по данным каталога соматических мутаций COSMIC [2]. Каталог COSMIC составлен по результатам анализа 16 тыс. публикаций, описывающих соматические мутации в общей сложности 25 тыс. генов в различных типах опухолей. Для поиска мутаций в этой категории генов использован ранее разработанный набор праймеров Ion AmpliSeq Comprehensive Cancer Panel (Life Technologies). Ампликоны набора перекрывают подавляющую часть кодирующих областей 409 генов, вовлеченных в опухолеобразование.
Мультиплексную ПЦР и последующие этапы подготовки библиотек фрагментов генома проводили с использованием набора реактивов Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 (Life Technologies) по протоколу производителя. Аликвоты по...
