STROKE №1 (29) / 2013
Отсроченное введение низкомолекулярного лиганда тропомиозин-зависимой киназы B способствует восстановлению после гипоксически-индуцированного ишемического инсульта
Departments of Neurology and Neurological Sciences and Neurosurgery, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA; the Department of Psychiatry, Weill Cornell Medical College, New York, NY; and the Department of Neurology and Laboratory for Computational Neurochemistry and Drug Discovery, Department of Veteran’s Affairs Medical Center and Department of Neurology, University of California–San Francisco, San Francisco, CA.
Предпосылки и цель исследования. Инсульт является основной причиной инвалидности в Соединенных Штатах, но в настоящее время не существует лекарственных препаратов, доказано эффективно улучшающих восстановление. Нейротрофический фактор головного мозга стимулирует нейрогенез и пластичность, т.е. процессы, которые участвуют в восстановлении после инсульта. Он связывается с рецепторами тропомиозин-зависимой киназы B и p75 нейротрофина. Тем не менее нейротрофический фактор головного мозга нельзя рассматривать в качестве потенциального терапевтического агента, т.к. не существует низкомолекулярных соединений, способных воспроизвести его связывание с обоими рецепторами. Изучили гипотезу о том, что малая молекула (LM22A-4), которая избирательно действует на тропомиозин-зависимую киназу B, будет способствовать нейрогенезу и функциональному восстановлению после инсульта. Методы. Четырехмесячных мышей обучали выполнению двигательных заданий до развития инсульта. После инсульта результаты функциональных тестов использовали для рандомизации мышей в 2 эквивалентные группы с тяжелыми нарушениями. Начиная с третьего дня после инсульта, мышам вводили LM22A-4 или физиологический раствор ежедневно в течение 10 недель. Результаты. Лечение LM22A-4 привело к значительному улучшению скорости поворота конечностей и ускорению восстановления нормальной точности походки после инсульта. На фоне лечения LM22A-4 также в два раза увеличилось количество новых зрелых нейронов и незрелых нейронов в регионе, непосредственно примыкающем к зоне поражения при инсульте. Лекарственно-индуцированных различий в ангиогенезе, разветвлении дендритов, разрастании аксонов, формировании глиальных рубцов или нейровоспалении не было. Выводы. Низкомолекулярный агонист тропомиозин-зависимой киназы B улучшает функциональное восстановление после инсульта и усиливает нейрогенез при применении спустя 3 дня после инсульта. Эти результаты являются доказательством правильности концепции того, что направление терапии на действие тропомиозин-зависимой киназы В способно самостоятельно стимулировать один или несколько механизмов, связанных с восстановлением после инсульта. В связи с этим LM22A-4 и его производные могут служить в качестве “про-восстановительных” терапевтических агентов при инсульте.
Весьма перспективными являются лекарственные препараты, улучшающие функциональное восстановление и/или уменьшающие инвалидизацию после перенесенного инсульта. Инсульт является основной причиной инвалидности в США (обновленные данные Американской кардиологической ассоциации 2010 г.), но новых препаратов для содействия восстановлению после инсульта не появилось.
Уже давно полагают, что нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) обладает нейрорегенеративной и провосстановительной активностью [1-3], но его не рассматривали в качестве терапевтического агента. Он характеризуется коротким периодом полувыведения в плазме, плохой проницаемостью через гематоэнцефалический барьер и в паренхиму головного мозга [4, 5]. Кроме того, маловероятно, что в будущем удастся найти низкомолекулярное соединение, которое будет воспроизводить все действия BDNF, в связи с размером и сложностью взаимодействия между BDNF и его рецепторами - тропомиозин-зависимой киназой B (TrkB) и р75-рецептором нейротрофина [6]. Физическое взаимодействие включает в себя несколько доменов белков и, хотя BDNF независимо связывается и активирует TrkB и р75-рецепторы нейротрофинов, они могут влиять на сигнальную систему друг друга [7]. Из этих двух рецепторов TrkB наиболее тесно связан с пластичностью и нейрогенезом [2, 8].
Проверили гипотезу о том, что частичная активация только TrkB рецепторов будет способствовать улучшению функционального восстановления после инсульта. LM22A-4, низкомолекулярный лиганд, предназначенный для имитации петли II домена BDNF, избирательно и специфически связывается с TrkB [9]. Он действует как частичный агонист, фосфорилируя TrkB и активируя несколько нижестоящих мишеней in vivo и in vitro [9]. Как и следовало ожидать от частичных агонистов, эффекты LM22A-4 качественно и количественно отличаются от нативного белка BDNF [9]. Обнаружили, что введение LM22A, начиная с 3-го дня после ишемического инсульта, приводит к значительному улучшению походки у мышей. Наблюдали улучшение в скорости поворота конечности при цифровом анализе походки, а введение LM22A-4 ускоряло возвращение к нормальной точности походки, по результатам тестов с лестницей. На фоне применения LM22A-4 в два раза увеличился нейрогенез в регионах мозга, непосредственно примыкающих к зоне поражения после инсульта, в частности в коре пенумбры и дорсолатеральной части полосатого тела.
Настоящее исследование впервые демонстрирует, что TrkB-специфический низкомолекулярный лиганд способен улучшить функциональное восстановление при условии, что лечение начинают во время клинически значимого временного окна через несколько дней после инсульта. Эти результаты стали доказательством концепции, что активация TrkB является потенциальным терапевтическим подходом для ускорения восстановления пациентов после инсульта.
МЕТОДЫ
Мыши
Всех животных для проведения исследования использовали в соответствии с утвержденными протоколами Стэнфордского Комитета по уходу и использованию животных (Stanford Institutional Animal Care and Use Committee). Опыты проводили в соответствии с Руководством по уходу и использованию животных Национальных институтов здравоохранения (National Institutes of Health Guide for Care and Use of Animals). В начале каждого эксперимента 321 самцу мышей C57BL/6J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 000664) было 4 месяца от рождения.
Медикаментозное лечение
LM22A-4 (N,N',N'-трис [2-гидроксиэтил])-1,3,5-бензол трикарбоксамид) синтезировали в Ricerca Biosciences (Конкорд, штат Огайо) и оценили методами жидкостной хроматографии, масс-спектроско- пии, а биологическую активность изучили, как было описано ранее [9]. Интраназальное дозирование препарата описано в дополнительных данных on-line. Бромдезоксиуридин (BrdU) растворяли в физиологическом растворе в дозе 5 мг/мл и вводили интраперитонеально в дозе 50 мг/кг/сут в течение 6 дней.
Поведение мышей
Оценили походку с использованием трех тестов: теста с горизонтальной лестницей [10], автоматизированного анализа спонтанной ходьбы (длина шага и скорость поворота; Noldus Catwalk) и теста Rotorod (San Diego Instruments). Информация о послеоперационном уходе, стратификации и результатах поведенческих тестов приведена в данных о дополнительных методах on-line.
Модели инсульта
Информация о процедуре инициации гипоксически-ишемического инсульта описана в данных о дополнительных методах on-line, а результаты гистологического исследования представлены на дополнительном рис. I on-line. У мышей окклюзировали правую сонную артерию, затем подвергали гипоксии; ложнооперированным мышам выполняли рассечение шеи без окклюзии сонной артерии или гипоксии. Из когорт удаляли мышей в случае летального исхода в течение 3 дней или при отсутствии выраженного функционального дефицита (около...