Побочные эффекты лечения инсульта у крыс с сахарным диабетом стромальными клетками костного мозга

01.01.2012
779

Предпосылки и цель исследования. Клеточная терапия стромальными клетками костного мозга (СККМ) улучшает функциональное восстановление после инсульта у крыс без диабета. Тем не менее ее эффективность при инсульте у крыс с сахарным диабетом неизвестна. В настоящем исследовании изучали влияние лечения СККМ на исходы после инсульта у крыс с сахарным диабетом 1 типа (СД1). Методы. Развитие СД1 у взрослых самцов крыс линии Wistar индуцировали путем введения стрептозотоцина. Крысам без сахарного диабета и с СД1 окклюзировали среднюю мозговую артерию (ОСМА) в течение 2 часов, затем, через 24 часа после ОСМА одной группе крыс ввели СККМ (3х106 клеток), другой (контрольной) СККМ не вводили. Наблюдение вели в течение 14 дней. Результаты. У СД1-ОСМА крыс после лечения СККМ не зарегистрировали улучшения функциональных исходов по сравнению с соответствующей контрольной группой СД1-ОСМА крыс. На фоне лечения СККМ у СД1-ОСМА крыс произошло повышение уровня летальности, повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), объем кровоизлияний в головной мозг был бóльшим, усилился ангиогенез. У СД1-ОСМА+СККМ крыс также наблюдали формирование неоинтимы внутренней сонной артерии и сужение церебральных артериол по сравнению с СД1-ОСМА крысами контрольной группы (р

Сахарный диабет инициирует целый каскад событий, ведущих к развитию дисфункции эндотелиальных клеток сосудов, повышению проницаемости сосудов [1] и ухудшению восстановления после ишемического инсульта [2]. Введение тканевого активатора плазминогена при инсульте замедляет увеличение зоны инфаркта у лиц без диабета, но не у пациентов, страдающих сахарным диабетом [3], и ассоциировано с повышением частоты развития внутримозговых кровоизлияний и неблагоприятных исходов [4]. Таким образом, ответ на лечение инсульта у пациентов с сахарным диабетом может отличаться от ответа на лечение у лиц, им не страдающих. Терапия стромальными клетками костного мозга (СККМ) является перспективным подходом к улучшению регенерации и восстановлению функций после инсульта у крыс без диабета. Лечение СККМ стимулирует ангиогенез, стабилизацию тонуса сосудов, а также способствует функциональному восстановлению после инсульта у крыс без сахарного диабета [5, 6]. СККМ обладают сильной адгезивной способностью и способствуют ремоделированию пораженных сосудов, но вызывают гиперплазию интимы [7]. У животных с сахарным диабетом часто развиваются поражения сосудов, и они предрасположены к развитию артериосклероза. До настоящего времени влияние лечения СККМ на исходы после инсульта и поражения сосудов у животных с сахарным диабетом не изучали.

Ангиогенин является членом суперсемейства рибонуклеазы и способствует разрушению базальной мембраны и внеклеточного матрикса, позволяя эндотелиальным клеткам пролиферировать, пенетрировать и мигрировать в периваскулярные ткани [8]. Уровень ангиогенина в плазме ассоциирован с тяжестью сердечной недостаточности [9], он участвует в патогенезе ишемии миокарда [10] и связан с воспалением и артериосклерозом. Тем не менее роль ангиогенина в ангиогенной реакции при ишемическом инсульте неизвестна, особенно у животных с сахарным диабетом и ишемическим инсультом. В настоящем исследовании изучили клинически значимый вопрос о влиянии лечения инсульта СККМ на функциональные исходы и экспрессию ангиогенина у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом 1 типа (СД1).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

У взрослых самцов крыс линии Wistar (225–250 г; Jackson Laboratory, Уилмингтон, Миннесота) индуци-ровали развитие СД1 путем однократного внутрибрю-шинного введения стрептозотоцина (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, штат Миссури, 60 мг/кг) [11]. Уровень глюкозы натощак определяли с помощью глюкомет-ра (Accu-Chek Compact System, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Критерием наличия СД было содержание глюкозы в крови натощак >300 мг/дл. Проведение исследований на животных начинали через 2 недели после индукции СД.

Культуры СККМ

У нормальных самцов крыс линии Wistar (n=6/группа) выделяли костный мозг и культивировали в модифицированной Иглом среде α-Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сывороткой и 1% стрептомицином. Клетки выдерживали при температуре 37 °С в 5% CO2 и неадгезированные клетки удаляли. СККМ использовали после выполнения 4 пассажей.

Модель окклюзии средней мозговой артерии и экспериментальная группа животных

Крысам дикого типа без СД (ДТ; Jackson Laboratory, Уилмингтон, Массачусетс) и крысам с СД1 сначала провели наркоз 3,5% галотаном, затем поддерживали концентрацию галотана на уровне от 1,0 до 2,0%. Для временной (2 часа) окклюзии правой средней мозговой артерии (ОСМА) использовали модель с наложением жгутика, как было описано ранее [5]. Через 2 часа ОСМА, после удаления жгутика восстанавливали кровоток. Ложно-оперированным животным проводили аналогичное хирургическое вмешательство, за исключением наложения кетгута.

Крыс рандомизировали и разделили на различные группы, через 24 часа после вмешательства путем внутривенного введения через хвостовую вену им проводили различное лечение. Контрольной группе, включающей ДТ-ОСМА крыс, вводили физиологический раствор с фосфатным буфером (n=8), крысам группы ДТ-ОСМА+СККМ (n=8) вводили СККМ (3.106 клеток), крысами СД1-ОСМА контрольной группы - физиологический раствор с фосфатным буфером (n=13), крысам группы (n=12) СД1-ОСМА+СККМ — СККМ (3.106 клеток), ложно-оперированным крысам ДТ контрольной группы (n=4) и ложно-оперированным крысам с СД1 (n=4) — физиологический раствор с фосфатным буфером.

В ранее проведенных исследованиях продемонстрировали, что лечение СККМ (3.106 клеток) улучшает функциональные исходы после инсульта у ДТ-ОСМА крыс [5]. В связи с этим использовали дозу 3.106 СККМ. Провели батареи функциональных тестов до ОСМА и через 1, 7 и 14 дней после ОСМА. Для проведения иммунного окрашивания крыс подвергали эвтаназии через 14 дней после выполнения ОСМА.

Неврологические функциональные тесты

Эксперт, ослепленный относительно данных об экспериментальных группах, провел тест на удаление клея – Foot-fault-тест – и выполнил оценку по модифицированной шкале тяжести неврологических нарушений

[5]. Модифицированная шкала тяжести неврологических нарушений (мШТНН) представляет собой совокупность моторных, сенсорных, рефлекторных тестов

и тестов на равновесие. Из исследования исключали крыс с оценкой по мШТНН 13 баллов до начала лечения.

Уровень летальности

Подсчитали число погибших животных в каждой группе и уровень летальности представили в виде отно-шения числа крыс, умерших в период от 24 часов до 14 дней после ОСМА, к общему числу животных каждой группы.

Определение объема внутримозговой гематомы

Объем внутримозговой гематомы измеряли с помощью окрашивания мазков гематоксилином и эозином и изучали под световым микроскопом, включая образцы от животных, умерших в ранние сроки после инсульта. В каждом гистологическом срезе измеряли и суммировали доли зон петехиальных и крупных кровоизлияний.

Определение проницаемости гематоэнцефалического барьера

ДТ-ОСМА и СД1-ОСМА крысам (n=5 в каждой группе) вводили СККМ (3.106 клеток). Через пять дней после выполнения ОСМА, за 2 часа до эвтаназии внутривенно вводили 2% синий краситель Эванса. Интенсивность флуоресценции синего красителя Эванса измеряли с помощью микропланшентного флуорометра (возбуждение 620 нм и излучение 680 нм) [12].

Объем поражения и гистологическое исследование

Все ткани мозга зафиксировали путем транскардиальной перфузии физиологического раствора с последующей перфузией и погружением в 4% параформальдегид, а затем залили парафином. Обработали семь корональных срезов тканей и окрасили гематоксилином и эозином для расчета объема поражения и представили данные в виде соотношения объема поражения к объему контралатерального полушария. Стандартный блок изображений получали из центра очага поражения (брегма от -1 мм до +1 мм). От блока отделяли серии срезов толщиной 6 мкм. Каждый десятый корональный срез до общего числа в 5 срезов использовали для иммуногистохимического окрашивания. Использовали антитела к фактору Виллебранда (маркер эндотелиальной клетки, 1:400, Dako, Carpinteria, Калифорния), α-актину гладких мышц (маркер ГМК, мышиный моноклональный IgG 1:800; Dako), ангиогенину (моноклональный, 1:500; Abcam, Кембридж, Миннесота), мышиному микро-альбумину против микроглии/макрофагов крыс (ED1, моноклональный, 1:30; AbD Serotec Raleigh, Северная Каролина). Контрольные эксперименты состояли из окрашивания корональных срезов тканей мозга, как указано ранее, но неиммунную сыворотку заменили на первичные антитела. Иммунные анализы проводил эксперт, ослепленный относительно данных об экспериментальных группах.

Количественное определение экспрессии ангиогенина и ED1

Каждый слайд, содержащий 8 полей зрения пограничной зоны ишемии, оцифровали (Olympus BX40) совместно с системой анализа изображений MCID (Imaging Research, St. Catharines, Канада). Пограничной зоной ишемии считали область, окружающую очаг поражения. Данные 5 срезов и 8 областей в каждом срезе усреднили для получения единого значения для 1 животного и представили в виде процентного отношения к области, содержащей положительно окрашенные иммунореактивные клетки соответственно. Измерили экспрессию ангиогенина и ED1 во внутренней сонной артерии и представили результат в виде процентного отношения к общей площади исследованной области стенки артерии.

Измерение плотности сосудов

Плотность сосудов в корональном срезе, окрашенном антителами к фактору Виллебранда, оцифровали и рассчитали плотность сосудов в пограничной зоне ишемии с помощью компьютерной системы анализа изображений MCID.

Измерение плотности сосудов, окрашенных антителами к α-актину гладких мышц, определение толщины стенок артерий и окклюзии

В пограничной зоне ишемии проанализировали плотность сосудов, окрашенных антителами к α-актину гладких мышц для визуализации мелких и крупных сосудов (≥10 мкм в диаметре) [10]. Определили максимальную толщину стенок 10 артерий. Подсчитали число сосудов, иммунореактивных к α-актину гладких мышц. Представили общее число сосудов, иммунореактивных к α-актину гладких мышц, на миллиметр в квадрате. Кроме того, подсчитали общее число окклюзированных артерий в ипсилатеральном полушарии.

Трехцветное окрашивание и измерение

Используя систему одноэтапного трехцветного окрашивания по Гомори (Sigma, Сент-Луис, Миссури), срезы мозга постфиксировали в фиксаторе Буэна. Ядра окрашивали гематоксилином Вейгерта, затем окрашивали трехцветной окраской по Гомори с последующим промыванием 0,5% уксуснокислой водой. При этом соединительная ткань и коллаген окрасились в синий цвет, ядра – в темно-красный/фиолетовый цвет, а цитоплазма – в красный/розовый цвет. В ипсилатеральной и контралатеральной внутренних сонных артериях измеряли толщину комплекса интима-медиа, а также диаметр сосуда (минимальный диаметр).

Отложение коллагена

С помощью модифицированного окрашивания пикросириусом красным [13], срезы постфиксировали в жидкости Буэна, затем окрасили железным гематоксилином, а потом – 0,1% пикросириусом красным. Отложение коллагена выразили в виде отношения площадей интерстициального и периваскулярного отложений коллагена к площади просвета внутренней сонной артерии.

Двойное иммуногистохимическое окрашивание

Для проведения двухмаркерного иммунофлуоресцентного анализа использовали флуоресцеина изотиоцианат (Calbiochem) и цианин-5.18 (Jackson Immunoresearch). Каждый коронарный срез сначала обрабатывали первичными антителами к ангиогенину с цианином 5.18, а затем антителами к ED1 с флуоресцеином изотиоцианатом. Контрольные эксперименты проводили с помощью окрашивания корональных срезов тканей мозга, как описано ранее, но использовали неиммунную сыворотку для первичных антител.

Статистический анализ

Односторонний дисперсионный анализ использовали для оценки функциональных исходов и данных гистологии. Положение “контраст/оценка” использовали для проверки групповых различий. Для изучения корреляции между результатами функциональных тестов и данными гистологического исследования на 14-й день после ОСМА рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Если общий эффект группы лечения достигал р

РЕЗУЛЬТАТЫ

Введение СККМ приводит к повышению показателей ранней летальности без уменьшения размера очага поражения и улучшения функциональных исходов у СД1-ОСМА крыс

Не было существенных различий в уровне глюкозы в крови между контрольной группой СД1-ОСМА (до ОСМА — 409,1±46,9 мг/дл; перед эвтаназией — 413,3±51,4 мг/дл) и группой лечения СККМ (до ОСМА — 441,7±34,5 мг/дл; перед эвтаназией 417,7±41,2 мг/дл; р>0,05). Летальность была выше в группе СД1-ОСМА+СККМ – 6 (50%) из 12 крыс (1 крыса контрольной ДТ-ОСМА группы, 1 крыса из группы лечения ДТ-ОСМА+СККМ, 4 крысы контрольной группы СД1-ОСМА и 6 крыс группы лечения СД1-ОСМА+СККМ) по сравнению с группой крыс контрольной СД1-ОСМА группы – 4 (31%) из 13. В ранее проведенных исследованиях показали, что лечение СККМ при инсульте приводит к значительному улучшению функциональных исходов у крыс без СД [5]. Тем не менее лечение инсульта СККМ у крыс с СД1 не привело к улучшению функциональных исходов (рис. 1A–В) и уменьшению объема очага поражения (рис. 1Г).

Рисунок 1. Лечение инсульта СККМ у крыс с СД1 не приводит к улучшению функциональных исходов и уменьшению объема поражения

Введение СККМ приводит к повышению проницаемости гематоэнцефалического барьера, увеличению объема кровоизлияний в мозг и увеличению плотности сосудов у крыс с СД1

У СД1-ОСМА крыс произошло значительно повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера – ГЭБ (рис. 2A, см. на цв. вклейке), увеличение объема кровоизлияний в мозг (рис. 2Б, см. на цв. вклейке), и повышение плотности сосудов (рис. 2В, см. на цв. вклейке) по сравнению с ДТ-ОСМА крысами (р0,05). Лечение СККМ у ДТ-ОСМА крыс не привело к увеличению объема кровоизлияний в мозг, но существенно снизило проницаемость ГЭБ (рис. 2A, см. на цв. вклейке) и повысило плотность сосудов (рис. 2В, см. на цв. вклейке; р0,05) по сравнению с ДТ-ОСМА крысами. Тем не менее введение СККМ крысам груп-пы СД1-ОСМА привело к значительному повышению у них проницаемости ГЭБ (рис. 2A, см. на цв. вклейке), увеличению объема кровоизлияний в мозг (рис. 2Б, см. на цв. вклейке) и увеличению плотности сосудов (рис. 2В, см. на цв. вклейке; р0,05) по сравнению с крысами группы СД1-ОСМА.

Рисунок 2. Лечение СККМ у СД1-ОСМА крыс привело к значительному повышению проницаемости ГЭБ, увеличению объема кровоизлияний в мозг и повышению плотности сосудов в ишемизированном мозге. А — изучение проницаемости ГЭБ с помощью синего красителя Эванса (n=5 в каждой группе). Б-В — измерение объема кровоизлияний в мозг (Б) и плотности сосудов (В).
Масштабная линия на рис. Б и В =0,1 мм. СККМ — стромальные клетки костного мозга; СД1 — сахарный диабет 1 типа; ОСМА — окклюзия средней мозговой артерии; ГЭБ — гематоэнцефалический барьер

Введение СККМ приводит к утолщению стенки церебральных артерий и повышению частоты развития окклюзии у крыс группы СД1-ОСМА

В группах СД1-ОСМА и СД1-ОСМА+СККМ отметили значительное повышение плотности стенок артерий (рис. 3Б, см. на цв. вклейке), утолщение стенок церебральных артерий (рис. 3В, см. на цв. вклейке) и окклюзию артерий (рис. 3Г, см. на цв. вклейке) по сравнению с крысами группы ДТ-ОСМА (р0,05). Введение СККМ крысам СД1-ОСМА также привело к значительному утолщению стенок церебральных артерий (рис. 3В, см. на цв. вклейке) по сравнению с крысами контрольной группы СД1-ОСМА.

Рисунок 3. Лечение СККМ крыс группы СД1-ОСМА привело к значительному утолщению стенок церебральных артерий и увеличению числа окклюзированных артерий. А — окрашивание α-АГМ. Б-Г — количественные данные о плотности артерий (Б), толщине стенок церебральных артерий (В), и окклюдированных церебральных артериях (Г) в ишемизированном мозге. Масштабная линия на
рис. А =0,1 мм. СККМ — стромальные клетки костного мозга; СД1 — сахарный диабет 1 типа; ОСМА — окклюзия средний мозговой артерии; α-АГМ — α-актин гладких мышц

Введение СККМ способствует утолщению интимы внутричерепных артерий и отложению коллагена у крыс группы СД1-ОСМА

Трехцветное окрашивание использовали для определении влияния лечения СККМ на развитие артериосклероза у крыс с СД1. Введение СККМ у СД1-ОСМА крыс привело к значительному повышению толщины интимы (рис. 4А) и отложению коллагена (рис. 4В; р0,05) и снижению диаметра артерий (рис. 4Б) в ипсилатеральной внутренней сонной артерии (ВСА) по сравнению с СД1-ОСМА или ДТ-ОСМА крысами (р0,05) (рис. 4A–Б).

Рисунок 4. Лечение СККМ у крыс группы СД1-ОСМА привело к ускорению процесса артериосклероза в ВСА

Введение СККМ приводит к повышению уровня экспрессии ангиогенина и ED1 у крыс группы СД1-ОСМА

Для получения представления о возможных основных механизмах, лежащих в основе развития СККМ-индуцированного повышения проницаемости ГЭБ, кровоизлияний в мозг и утолщения интимы у СД1-ОСМА крыс, определили уровень экспрессии ангиогенина и ED1. У СД1-ОСМА+СККМ крыс значи-тельно повысился уровень экспрессии ангиогенина в пограничной зоне ишемии (р0,05, рис. 5А, см. на цв. вклейке) и незначительно повысился уровень экспрессия ангиогенина (р=0,07, рис. 5Б, см. на цв. вклейке) и ED1 (р0,05, рис. 5В, см. на цв. вклейке) в ВСА по сравнению с контрольной группой СД1-ОСМА крыс. Тем не менее у ДТ-ОСМА+СККМ крыс не произошло увеличения толщины интимы, диаметра артерий, отложения коллагена и уровня экспрессии ED1 и ангиогенина в ишемизированном мозге и ВСА по сравнению с контрольной группой ДТ-ОСМА крыс (р>0,05). Существенных различий в плотности сосудов, плотности артерий, уровне экспрессии ангиогенина и ED1 и толщине интимы в ВСА между ложно-оперированными животными ДТ и СД1 контрольных групп не было (дополнительный рис. I см. on-line). Тем не менее число окклюзированных церебральных артериол было незначительно выше (р=0,06) у ложно-оперированных крыс с СД1 по сравнению с ложно-оперированными крысами группы ДТ.

Рисунок 5. У крыс группы СД1-ОСМА повышена экспрессия ангиогенина, а на фоне лечения СККМ у СД1-ОСМА крыс произошло значительное повышение уровня экспрессии ангиогенина и ED1. А-Б — иммунное окрашивание ангиогенина и количественные данные об уровне его экспрессии в ПЗИ (A) и ВСА (Б). В — иммунное окрашивание ED1 и количественные данные об уровне его экспрессии в ВСА. Масштабная линия на рис. А-В =0,1 мм. СД1 — сахарный диабет 1 типа; ОСМА — окклюзия средней мозговой артерии; СККМ — стромальные клетки костного мозга; ПЗИ — пограничная зона ишемии; ВСА — внутренняя сонная артерия

Уровень экспрессии ангиогенина коррелирует с уровнем экспрессии ED1 и выраженностью артериосклероза у СД1-ОСМА крыс

Экспрессия ангиогенина находилась в прямой зависимости от экспрессии ED1 в ишемизированном мозге (рис. 6А, см. на цв. вклейке). Повышение экспрессии ангиогенина достоверно коррелировало с экспрессией ED1 (рис. 6Б, см. на цв. вклейке) и утолщением церебральных артерий (рис. 6В, см. на цв. вклейке).

Рисунок 6. Экспрессия ангиогенина коррелирует с экспрессией ED1. Экспрессия ангиогенина достоверно коррелировала с экспрессией ED1 и толщиной стенок церебральных артерий в ишемизированном головном мозге. А — двойное окрашивание ангиогенина и ED1 в ишемизированном головном мозге. Б — корреляционный анализ экспрессии ангиогенина и ED1. В — корреляционный анализ содержания ангиогенина и толщины стенок церебральных артерий

ОБСУЖДЕНИЕ

Лечение СККМ приводит к повышению проницаемости ГЭБ, увеличению объема кровоизлияний в мозг и не влияет на улучшение функциональных исходов после инсульта у крыс группы СД1-ОСМА

Изменения сосудов после инсульта у крыс без диабета и крыс группы СД1-ОСМА могут отличаться. После инсульта у животных с СД произошло усиление ангиогенных реакций, повышение проницаемости ГЭБ и снижение уровня экспрессии белков плотных контактов [14]. Ранние нарушения ГЭБ способствуют развитию внутримозговых кровоизлияний. Внутримозговая геморрагическая трансформация является многофакторным явлением, при котором в ишемизированной ткани мозга развивается геморрагическое пропитывание с повышением проницаемости кровеносных сосудов и развитием кровоизлияния, тем самым усугубляется повреждение головного мозга. Эти особенности реакции сосудов на инсульт могут быть причиной развития побочных эффектов терапии СККМ, наблюдаемых у СД1-ОСМА крыс. Обнаружили, что лечение СККМ при инсульте у СД1-ОСМА крыс способствует повышению плотности сосудов и артерий, а также приводит к повышению частоты развития кровоизлияний в мозг, повышению проницаемости ГЭБ, но не улучшает функциональных исходов. Повышение проницаемости ГЭБ и увеличение объема внутримозговых кровоизлияний могут способствовать росту уровня ранней смертности животных СД1-ОСМА. Лечение СККМ СД1-ОСМА крыс также индуцировало развитие артериосклероза, проявившееся в утолщении интимы церебральных артерий и окклюзии артериол, что может негативно влиять на восстановление функций после инсульта. В то же время у крыс без диабета СККМ-терапия инсульта привела не только к повышению плотности сосудов, стабилизации сосудов и снижению проницаемости ГЭБ, но и к улучшению функциональных исходов после инсульта [5, 15]. Это первое исследование, в котором продемонстрировали, что терапия СККМ оказывает негативное влияние на ремоделирование сосудов и функциональные исходы у СД1-ОСМА крыс. Таким образом, благоприятный эффект введения СККМ через 24 часа от начала инсульта нельзя транслировать на страдающих сахарным диабетом.

Лечение СККМ усугубляет церебральный артериосклероз после инсульта у крыс группы СД1-ОСМА

Механизмы, лежащие в основе развития неблагоприятных сосудистых реакций или артериосклероза при проведении терапии СККМ у СД1-ОСМА крыс, неизвестны. Толщина комплекса интима-медиа в сонной артерии является ранним признаком атеросклероза и макрососудистых заболеваний [16]. Лечение СККМ у СД1-ОСМА крыс привело к значительному увеличению толщины комплекса интима-медиа и окклюзии внутримозговых артериол и снижению диаметра ВСА по сравнению с контрольной группой СД1-ОСМА крыс. Уровень экспрессии ED1 в ВСА был значительно выше у СД1-ОСМА крыс, получавших СККМ. Субэндотелиальная инфильтрация лейкоцитами является характерным признаком утолщения неоинтимы при атеросклерозе и реакцией сосудов на механическое повреждение, а нейтрофилы также способствуют утолщению неоинтимы в модели с использованием аутотрансплантата артерии [17]. Таким образом, выраженная воспалительная реакция при инсульте может способствовать развитию артериосклероза у СД1-ОСМА крыс на фоне лечения СККМ.

Артериосклероз и ригидность артериальных стенок являются факторами риска развития инсульта [18]. Аномальный обмен коллагена и усиленный фиброз имеют общую патофизиологическую связь с повышением ригидности стенок артерий. При СД повышается ригидность артериальной стенки, и его наличие ассоциировано с изменениями биохимической трансформации коллагена в кровеносных сосудах [19]. У СД1-ОСМА крыс, получавших СККМ, отложение коллагена было незначительно повышено. Усиление фиброза на фоне применения СККМ может ускорять развитие артериосклероза и повреждений внутримозговых артерий у СД1-ОСМА крыс.

Ангиогенин может способствовать СККМ-индуцированному ангиогенезу, повышению проницаемости ГЭБ и развитию артериосклероза у крыс группы СД1-ОСМА

Ангиогенин является мощным фактором роста кровеносных сосудов, разрушающим базальную мембрану, тем самым способствуя инфильтрации и миграции клеток [20]. Тяжесть микрососудистых осложнений ассоциирована с заметным повышением уровня ангиогенина в сыворотке крови [21]. Уровень ангиогенина повышается у пациентов с окклюзией периферических артерий [22] и у молодых лиц с СД [23].

СККМ ведут себя как маленькие биохимическиеи молекулярные “фабрики” по производству множества цитокинов и большого количества ангиогенных, антиапоптотических и митогенных факторов [24]. У СД1-ОСМА крыс по сравнению с крысами контрольной ДТ-ОСМА группы отметили значительное повышение уровня ангиогенина, а у СД1-ОСМА крыс, получавших СККМ, была повышена экспрессия ангиогенина в ишемизированном мозге. Повышение экспрессии ангиогенина достоверно коррелировало с экспрессией ED1 и толщиной стенки церебральных артерий, что согласуется с данными о достоверной корреляции экспрессии ангиогенина с количеством микрососудов и очаговой инфильтрацией макрофагами [25].

Ограничения и предостережения

В настоящем исследовании существует целый ряд ограничений и предостережений. В этом первичном исследовании проводили лечение СККМ крыс через 2 недели после индукции развития СД. Для улучшения клинической значимости результатов оправдано проведение дополнительных исследований у крыс с более длительным течением СД на фоне контроля и коррекции уровня глюкозы крови, и введения СККМ в более поздние сроки, чем через 24 часа после развития инсульта. Кроме того, многие другие факторы, а не только повышение уровня ангиогенина, могут способствовать развитию неблагоприятных последствий лечения СККМ инсульта у крыс с СД1. Матриксная металлопротеиназа-9, фактор роста эндотелия сосудов и иммунореактивность также могут, по крайней мере частично, быть причиной развития СККМ-индуцированных неблагоприятных эффектов после инсульта у крыс с СД1. Необходимо дальнейшее изучение механизмов, лежащих в основе развития СККМ-индуцированных неблагоприятных эффектов у крыс с СД1.

ВЫВОДЫ

Проведение лечения СККМ через 24 часа после ОСМА на фоне СД1 приводит к увеличению объема кровоизлияний в мозг, повышению проницаемости ГЭБ, ускоряет развитие церебрального артериосклероза и не влияет на улучшение функциональных исходов. Повышение уровня экспрессии ангиогенина может способствовать развитию неблагоприятных последствий лечения СККМ у СД1-ОСМА крыс. Эти данные свидетельствуют о том, что необходимо проявлять осторожность при трансляции терапевтической эффективности лечения СККМ у лиц без СД на лиц с СД, считая наличие СД возможным критерием исключения для раннего начала терапии СККМ после инсульта.

Список литературы

1. Li W., Prakash R., Kelly-Cobbs A.I., Ogbi S., Kozak A., El-Remessy A.B., et al. Adaptive cerebral neovascularization in a model of type 2 diabetes: relevance to focal cerebral ischemia. Diabetes. 2010;59:228–235.

2. Capes S.E., Hunt D., Malmberg K., Pathak P., Gerstein H.C. Stress hyperglycemia and prognosis of stroke in nondiabetic and diabetic patients: a systematic overview. Stroke. 2001;32:2426–2432.

3. De Silva D.A., Ebinger M., Christensen S., Parsons M.W., Levi C., Butcher K., et al. Baseline diabetic status and admission blood glucose were poor prognostic factors in the EPITHET trial. Cerebrovasc Dis. 2010;29:14–21.

4. Alvarez-Sabin J., Molina C.A., Montaner J., Arenillas J.F., Huertas R, Ribo M, et al. Effects of admission hyperglycemia on stroke outcome in reperfused tissue plasminogen activator-treated patients. Stroke. 2003;34:1235–1241.

5. Chen J., Li Y., Wang L., Zhang Z., Lu D., Lu M., et al. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke. 2001;32:1005–1011.

6. Zacharek A., Chen J., Cui X., Li A., Li Y., Roberts C., et al. Angiopoietin1/Tie2 and VEGF/Flk1 induced by MSC treatment amplifies angiogenesis and vascular stabilization after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 2007;27:1684–1691.

7. Wang C.H., Cherng W.J., Yang N.I., Kuo L.T., Hsu C.M., Yeh H.I., et al.
Late-outgrowth endothelial cells attenuate intimal hyperplasia contributed by mesenchymal stem cells after vascular injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008;28:54–60.

8. Hu G.F., Riordan J.F., Vallee B.L. A putative angiogenin receptor in angiogenin-responsive human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2204–2209.

9. Patel J.V., Sosin M., Gunarathne A., Hussain I., Davis R.C., Hughes E.A., et al. Elevated angiogenin levels in chronic heart failure. Ann Med. 2008;40:474–479.

10. Tello-Montoliu A., Marin F., Patel J., Roldan V., Mainar L., Vicente V., et al. Plasma angiogenin levels in acute coronary syndromes: implications for prognosis. Eur Heart J. 2007;28:3006–3011.

11. Like A.A., Rossini A.A. Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus. Science. 1976;193:415–417.

12. Zhang Z.G., Zhang L., Croll S.D, Chopp M. Angiopoietin-1 reduces cerebral blood vessel leakage and ischemic lesion volume after focal cerebral embolic ischemia in mice. Neuroscience. 2002;113:683–
687.

13. Peng H., Carretero O.A., Vuljaj N., Liao T.D., Motivala A., Peterson E.L., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibitors: a new mechanism of action. Circulation. 2005;112:2436–2445.

14. Cui X., Chopp M., Zacharek A., Ye X., Roberts C., Chen J. Angiopoietin/ Tie2 pathway mediates type 2 diabetes induced vascular damage after cerebral stroke. Neurobiol Dis. 2011;43:285–292.

15. Borlongan C.V., Lind J.G., Dillon-Carter O., Yu G., Hadman M., Cheng C., et al. Bone marrow grafts restore cerebral blood flow and blood brain barrier in stroke rats. Brain Res. 2004;1010:108–116.

16. Gul K., Ustun I., Aydin Y., Berker D., Erol K., Unal M., et al. Carotid intima-media thickness and its relations with the complications in patients with type 1 diabetes mellitus. Anadolu Kardiyol Derg. 2010;10:52–58.

17. Jurado F., Bellon J.M., Rodriguez M., Corrales C., Bujan J. Inflammatory cells induce neointimal growth in a rat arterial autograft model. Histol Histopathol. 2002;17:817–826.

18. Agabiti-Rosei E., Muiesan M.L. Carotid atherosclerosis, arterial stiffness and stroke events. Adv Cardiol. 2007;44:173–186. Reddy GK. Age-related cross-linking of collagen is associated with aortic wall matrix stiffness in the pathogenesis of drug-induced diabetes in rats. Microvasc Res. 2004;68:132–142.

19. Hu G, Riordan J.F., Vallee B.L. Angiogenin promotes invasiveness of cultured endothelial cells by stimulation of cell-associated proteolytic activities. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994;91:12096–12100.

20. Chiarelli F., Pomilio M., Mohn A., Tumini S., Verrotti A., Mezzetti A., et al. Serum angiogenin concentrations in young patients with diabetes mellitus. Eur J Clin Invest. 2002;32:110–114.

21. Burgmann H., Hollenstein U., Maca T., Zedwitz-Liebenstein K., Thalhammer F., Koppensteiner R., et al. Increased serum laminin and angiogenin concentrations in patients with peripheral arterial occlusive disease. J Clin Pathol. 1996;49:508–510.

22. Malamitsi-Puchner A., Sarandakou A., Dafogianni C., Tziotis J., Bartsocas C.S. Serum angiogenin levels in children and adolescents with insulindependent diabetes mellitus. Pediatr Res. 1998;43:798–800.

23. Nagaya N., Kangawa K., Itoh T., Iwase T., Murakami S., Miyahara Y., et al. Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy. Circulation. 2005;112:1128–1135.

24. Etoh T., Shibuta K., Barnard G.F., Kitano S., Mori M. Angiogenin expression in human colorectal cancer: the role of focal macrophage infiltration. Clin Cancer Res. 2000;6:3545–3551.

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь