Побочные эффекты лечения инсульта у крыс с сахарным диабетом стромальными клетками костного мозга

Предпосылки и цель исследования. Клеточная терапия стромальными клетками костного мозга (СККМ) улучшает функциональное восстановление после инсульта у крыс без диабета. Тем не менее ее эффективность при инсульте у крыс с сахарным диабетом неизвестна. В настоящем исследовании изучали влияние лечения СККМ на исходы после инсульта у крыс с сахарным диабетом 1 типа (СД1). Методы. Развитие СД1 у взрослых самцов крыс линии Wistar индуцировали путем введения стрептозотоцина. Крысам без сахарного диабета и с СД1 окклюзировали среднюю мозговую артерию (ОСМА) в течение 2 часов, затем, через 24 часа после ОСМА одной группе крыс ввели СККМ (3х106 клеток), другой (контрольной) СККМ не вводили. Наблюдение вели в течение 14 дней. Результаты. У СД1-ОСМА крыс после лечения СККМ не зарегистрировали улучшения функциональных исходов по сравнению с соответствующей контрольной группой СД1-ОСМА крыс. На фоне лечения СККМ у СД1-ОСМА крыс произошло повышение уровня летальности, повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), объем кровоизлияний в головной мозг был бóльшим, усилился ангиогенез. У СД1-ОСМА+СККМ крыс также наблюдали формирование неоинтимы внутренней сонной артерии и сужение церебральных артериол по сравнению с СД1-ОСМА крысами контрольной группы (р<0,05), но не с группой крыс без диабета. Кроме того, изучили основные механизмы, лежащие в основе развития СККМ-индуцированного повышения проницаемости ГЭБ и ускоренного повреждения сосудов у СД1-ОСМА крыс. Обнаружили, что экспрессия ангиогенина (фактора ангиогенеза) и ED1 (маркера макрофагов) была значительно повышена у СД1-ОСМА+СККМ крыс в ишемизированном мозге и внутренней сонной артерии по сравнению с СД1-ОСМА крысами, которым не вводили СККМ, но не у крыс без сахарного диабета. Выводы. Терапия СККМ у СД1-ОСМА крыс не приводит к улучшению функциональных исходов. Напротив, на ее фоне происходит повышение проницаемости ГЭБ и формирование неоинтимы в церебральных артериях, развивается артериосклероз, что, возможно, связано с повышенной экспрессией ангиогенина. Таким образом, лечение СККМ, начатое через 24 часа после ОСМА, может быть неэффективным у лиц с инсультом и сахарным диабетом.

Сахарный диабет инициирует целый каскад событий, ведущих к развитию дисфункции эндотелиальных клеток сосудов, повышению проницаемости сосудов [1] и ухудшению восстановления после ишемического инсульта [2]. Введение тканевого активатора плазминогена при инсульте замедляет увеличение зоны инфаркта у лиц без диабета, но не у пациентов, страдающих сахарным диабетом [3], и ассоциировано с повышением частоты развития внутримозговых кровоизлияний и неблагоприятных исходов [4]. Таким образом, ответ на лечение инсульта у пациентов с сахарным диабетом может отличаться от ответа на лечение у лиц, им не страдающих. Терапия стромальными клетками костного мозга (СККМ) является перспективным подходом к улучшению регенерации и восстановлению функций после инсульта у крыс без диабета. Лечение СККМ стимулирует ангиогенез, стабилизацию тонуса сосудов, а также способствует функциональному восстановлению после инсульта у крыс без сахарного диабета [5, 6]. СККМ обладают сильной адгезивной способностью и способствуют ремоделированию пораженных сосудов, но вызывают гиперплазию интимы [7]. У животных с сахарным диабетом часто развиваются поражения сосудов, и они предрасположены к развитию артериосклероза. До настоящего времени влияние лечения СККМ на исходы после инсульта и поражения сосудов у животных с сахарным диабетом не изучали.

Ангиогенин является членом суперсемейства рибонуклеазы и способствует разрушению базальной мембраны и внеклеточного матрикса, позволяя эндотелиальным клеткам пролиферировать, пенетрировать и мигрировать в периваскулярные ткани [8]. Уровень ангиогенина в плазме ассоциирован с тяжестью сердечной недостаточности [9], он участвует в патогенезе ишемии миокарда [10] и связан с воспалением и артериосклерозом. Тем не менее роль ангиогенина в ангиогенной реакции при ишемическом инсульте неизвестна, особенно у животных с сахарным диабетом и ишемическим инсультом. В настоящем исследовании изучили клинически значимый вопрос о влиянии лечения инсульта СККМ на функциональные исходы и экспрессию ангиогенина у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом 1 типа (СД1).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

У взрослых самцов крыс линии Wistar (225–250 г; Jackson Laboratory, Уилмингтон, Миннесота) индуци-ровали развитие СД1 путем однократного внутрибрю-шинного введения стрептозотоцина (Sigma Chemical Co, Сент-Луис, штат Миссури, 60 мг/кг) [11]. Уровень глюкозы натощак определяли с помощью глюкомет-ра (Accu-Chek Compact System, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Критерием наличия СД было содержание глюкозы в крови натощак >300 мг/дл. Проведение исследований на животных начинали через 2 недели после индукции СД.

Культуры СККМ

У нормальных самцов крыс линии Wistar (n=6/группа) выделяли костный мозг и культивировали в модифицированной Иглом среде α-Дульбекко с 20% эмбриональной телячьей сывороткой и 1% стрептомицином. Клетки выдерживали при температуре 37 °С в 5% CO2 и неадгезированные клетки удаляли. СККМ использовали после выполнения 4 пассажей.

Модель окклюзии средней мозговой артерии и экспериментальная группа животных

Крысам дикого типа без СД (ДТ; Jackson Laboratory, Уилмингтон, Массачусетс) и крысам с СД1 сначала провели наркоз 3,5% галотаном, затем поддерживали концентрацию галотана на уровне от 1,0 до 2,0%. Для временной (2 часа) окклюзии правой средней мозговой артерии (ОСМА) использовали модель с наложением жгутика, как было описано ранее [5]. Через 2 часа ОСМА, после удаления жгутика восстанавливали кровоток. Ложно-оперированным животным проводили аналогичное хирургическое вмешательство, за исключением наложения кетгута.

Крыс рандомизировали и разделили на различные группы, через 24 часа после вмешательства путем внутривенного введения через хвостовую вену им проводили различное лечение. Контрольной группе, включающей ДТ-ОСМА крыс, вводили физиологический раствор с фосфатным буфером (n=8), крысам группы ДТ-ОСМА+СККМ (n=8) вводили СККМ (3.106 клеток), крысами СД1-ОСМА контрольной группы - физиологический раствор с фосфатным буфером (n=13), крысам группы (n=12) СД1-ОСМА+СККМ — СККМ (3.106 клеток), ложно-оперированным крысам ДТ контрольной группы (n=4) и ложно-оперированным крысам с СД1 (n=4) — физиологический раствор с фосфатным буфером.

В ранее проведенных исследованиях продемонстрировали, что лечение СККМ (3.106 клеток) улучшает функциональные исходы после инсульта у ДТ-ОСМА крыс [5]. В связи с этим использовали дозу 3.106 СККМ. Провели батареи функциональных тестов до ОСМА и через 1, 7 и 14 дней после ОСМА. Для проведения иммунного окрашивания крыс подвергали эвтаназии через 14 дней после выполнения ОСМА.

Неврологические функциональные тесты

Эксперт, ослепленный относительно данных об экспериментальных группах, провел тест на удаление клея – Foot-fault-тест – и выполнил оценку по модифицированной шкале тяжести неврологических нарушений

[5]. Модифицированная шкала тяжести неврологических нарушений (мШТНН) предст...

Дж. Чен, К. Йе, Т. Йан, К. Занг, К.-П. Йанг, К. Куи, И. Куи, А. Захарек, К. Робертс, К. Ли, К. Даи, М. Лу, М. Чопп