Прогнозирование преждевременных родов путем комбинированного определения цитокинов и внеклеточной ДНК

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.1.86-91

04.02.2019
15

1 ФГБУ национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва 2 ФГБУН институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Цель исследования. Определение прогностической значимости комбинированного определения уровней общей и плодовой внеклеточной ДНК и цитокинов при преждевременных родах.
Материал и методы. Исследование проведено у 80 женщин. Основную группу составили 47 пациенток со спонтанными преждевременными родами, разделенные по срокам: 22–27 недель 6 дней (10), 28–33 недели 6 дней (13) и 34–36 недель 6 дней гестации (24). Группу контроля – 33 женщины с физиологически протекающей беременностью, родившие в срок. Уровень общей и плодовой внеклеточной ДНК в плазме крови оценен количественным ПЦР-анализом, путем определения концентрации промотора гена RASSF1A и его гиперметилированной части. Определение содержания цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFNγ и TNFα проведено мультиплексным методом. Прогностическая ценность была определена методом логистической регрессии.
Результаты. В основной группе уровень IL-6 был повышен на 22–27 неделе 6 дней беременности, при этом в 60% (p=0,003) случаев были обнаружены признаки внутриутробной инфекции. Уровень IL-8 был значительно увеличен в основной группе на 28–33 неделе 6 дней и 34–36 неделе 6 дней беременности. Различий между группами в частоте внутриутробной инфекции на 28–33 неделе 6 дней не наблюдалось. В основной группе на 34–36 неделе 6 дней в 37,5% случаев диагностирована внутриутробная инфекция (p=0,01). Концентрация плодовой внеклеточной ДНК была увеличена на 28–33 неделе 6 дней беременности. Для прогнозирования преждевременных родов при сроке 22–27 недель 6 дней наиболее точным было одновременное определение IL-6 и общей внеклеточной ДНК – AUС: 0,925 (95% CI, 0,83–1); при сроке 28–33 недели 6 дней одновременное определение IL-8 и плодовой внеклеточной ДНК – AUС: 0,92 (95% CI, 0,85–1); при сроке 34–36 недель 6 дней одновременное использование IL-8, общей и плодовой внеклеточной ДНК – AUС=0,92 (95% CI, 0,85–1).
Заключение. Комбинированное определение внеклеточной ДНК и цитокинов является перспективным подходом для прогнозирования преждевременных родов.

Несмотря на сохраняющуюся высокую частоту преждевременных родов (ПР), до настоящего времени нет единой концепции этиологии данного осложнения беременности. Ряд исследователей уделяет внимание изучению роли провоспалительных цитокинов в активации системного воспалительного ответа, и как следствие, в развитии родовой деятельности. Так, например, показано, что интерлейкин (IL)-8, активирующий миграцию нейтрофилов и высвобождение протеиназ может играть ключевую роль в развитии ПР [1–5]. Известно, что ПР, не ассоциированные с инфекцией, коррелируют с повышением уровня в плазме крови IL-8, а также IL-1, IL-6. Вместе с тем повышенные концентрации фактора некроза опухоли (TNF)α, IL-1, IL-6 были выявлены при ПР, которые были сопряжены с инфекцией [6, 7]. Кроме того, исследование амниотической жидкости также выявило повышение IL-6 при ПР при наличии внутриутробной инфекции [8, 9]. В настоящее время появились новые данные о том, что общая внеклеточная ДНК (овДНК) может индуцировать воспалительный ответ, который ассоциирован с ПР. В работах S. Illanes и соавт. [10] и M.S. Quezada [11] продемонстрировано, что циркулирующая плодовая внеклеточная ДНК (пвДНК) вызывает воспалительную реакцию, которая приводит к развитию спонтанной родовой деятельности. При этом наблюдалась активация Толл-подобных рецепторов-9 (TLR-9) и повышение уровня IL-6. В литературе представлено значительное количество исследований, указывающих на связь между высоким уровнем пвДНК и риском развития ПР [12, 13]. Установлено, что основной мишенью для внеклеточной ДНК являются TLR-9, которые взаимодействуют с неметилированными CpG последовательностями. Известно также, что TLR-9 нейтрофилов способны взаимодействовать с бактериальной ДНК, с последующей секрецией IL-8 и, в меньшей степени, IL-6 и TNFα [14]. Как отмечалось выше, уровень указанных цитокинов повышается у женщин с высоким риском ПР [6]. ПвДНК составляет 0,3 – 40% от овДНК [15], однако способность внеклеточной ДНК не фетального происхождения вызывать ПР изучена недостаточно.

Цель исследования: определение прогностической значимости комбинированного определения уровней общей и плодовой внеклеточной ДНК и цитокинов при ПР.

Материал и методы исследования

В исследование было включено 80 пациенток: из них I (основную) группу составили 47 пациенток с ПР; II группу (сравнения) – 33 пациентки со своевременными родами. Исследование было одобрено этическим комитетом ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Всеми пациентками было подписано информированное согласие на участие в данном исследовании. Образцы крови у женщин с ПР были получены в начале 1 периода родов и разделены на группы по гестационному сроку согласно рекомендациям ВОЗ: 22–27 недель 6 дней, 28–33 недели 6 дней и 34–36 недель 6 дней гестации. Для сравнения исследована кровь, полученная на тех же сроках от женщин с физиологически протекающей беременностью, родоразрешенных при доношенном сроке.

Определение концентрации цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона (IFN)γ и TNFα в плазме периферической крови проводили мультиплексным методом с использованием стандартной 8-плексной тест-системы «Bio-Plex Pro Human Cytokine 8-plex Assay» («Bio-Rad», США) на проточном лазерном иммуноанализаторе «Bio-Plex 200» («Bio-Rad», США). Результаты обрабатывали при помощи приложения «Bio-Plex Manager 6,0 Properties» («Bio-Rad», США). Содержание IL представлено в пг/мл.

5,0 мл периферической крови беременных женщин были собраны в вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА, и обработаны в течение часа после забора. Плазма была выделена центрифугированием в два этапа при 4°С: первый – 10 мин (200 g), второй – 10 мин (4500 g). Образцы плазмы хранили при температуре – 80°С. В работе количество овДНК в плазме крови у женщин было оценено количественной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) путем определения концентрации промотора гена RASSF1A. Оценка уровня пвДНК основана на данных о том, что в геноме плода промотор гена RASSF1A гиперметилирован [16], и, соответственно, концентрация его гиперметилированной части в крови матери будет соответствовать количеству геномных единиц пвДНК. Подробно методика выделения гиперметилированной части RASSF1A была описана в работе А.М. Красного и соавт. [17]. Для проведения ПЦР использовали амплификатор CFX96 («Bio Rad», USA). Температурный профиль реакции: 95°C 5 мин; 40 циклов: 95°C 10 с., 60°C 30 с. Последовательности праймеров и зондов представлены в таблице 1.

Статистическая обработка данных была произведена с помощью программы XLstat (Addinsoft, USA). Анализ значимости различий между группой ПР и группой сравнения проведен с использованием двухстороннего теста Манна-Уитни. Данные представлены в виде медианы (М), 1 и 3 квартилей (25%, 75%). Достоверными различия считались при p<0,05. Для оценки вероятности ПР и родов в срок была построена модель логистической регрессии.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ соматического и акушерского анамнеза, изучение состояния здоровья беременных не выявили статистически значимых различий. Также не установлено разницы в возрасте, индексе массы тела, уровне артериального давления, курении между пациентками обеих групп. Основные характеристики беременных с учетом сроков беременности представлены в таблице 2.

При анализе перинатальных исходов было установлено, что на сроке 22–27 недель 6 дней в 60% случаев в основной группе имела место врожденная инфекция у новорожденных (p=0,004), на сроке 28–32 недели 6 дней достоверных отличий не отмечено (p=0,34), а на сроке 33–36 недель 6 дней у 37,5% беременных основной группы диагностировалась внутриутробная инфекция (p=0,01). Приведенные результаты, с одной стороны, подтверждают взаимосвязь ПР с внутриутробной инфекцией, с другой – указывают на высокую значимость инфекции в реализации ПР на ранних сроках. Следует отметить, что корреляционный анализ установил взаимосвязь реализации внутриутробной инфекции у новорожденных с наличием у беременных кольпита, в том числе, кандидозного, герпес-вирусной инфекции, положительными результатами бактериального посева из шейки матки, которые можно рассматривать, как фактор риска развития ПР и внутриутробной инфекции.

Уровни овДНК, пвДНК, а также цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFNγ и TNFα в плазме крови беременных представлены в таблице 3.

При исследовании уровня цитокинов обнаружено, что при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней наблюдается значимое повышение только IL-6 в 1,7 раза относительно группы сравнения (p=0,004). На сроках 28–33 недели 6 дней и 34–36 недель 6 дней повышение IL-6 не выявлено. В то же время, уровень IL-8 не имел значимых отличий на сроке 22–27 недель 6 дней, однако достоверно повышался в 1,5 раза на сроке 28–33 неделе 6 дней (p=0,005) и на сроке 34–36 неделе 6 дней (p=0,008). Определение уровня овДНК установило достоверное его повышение при ПР, в отличие от группы сравнения на сроке 22–27 недель 6 дней в 2,3 раз (p=0,017), на сроке 28–33 недели 6 дней – в 2,8 раз (p=0,01) и на сроке 34–36 недели 6 дней – в 2 раза (p=0,006). Следует отметить, что содержание пвДНК было достоверно выше, в отличие от группы сравнения, только на сроке 28–33 неделе 6 дней (p=0,011).

Для определения прогностической ценности был применен метод логистической регрессии. В исходе проведенного анализа было установлено, что для прогнозирования ПР на сроке 22–27 недель 6 дней наиболее точным было одновременное определение IL-6 и овДНК – AUС: 0,925 (95% CI, 0,83–1); на сроке ПР 28–33 недели 6 дней – IL-8 и пвДНК – AUС: 0,92 (95% CI, 0,85–1); на сроке ПР 34–36 недель 6 дней – IL-8, овДНК и пвДНК –AUС=0,92 (95% CI, 0,85–1).

В проведенном ранее исследовании указывалось на повышение IL-6 при ПР [18]. Нами также установлен повышенный уровень IL-6 при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней, в то же время на более поздних сроках при ПР повышения IL-6 мы не отметили. Принимая во внимание высокую частоту внутриутробной инфекции (60%) при ПР на сроке 22–27 недель 6 дней можно предположить инфекционный генез ПР в этих сроках, который реализуется посредством повышения IL-6 в плазме крови. Вышеуказанные данные согласуются с данными R. Romero и соавт. [9], указывающих на инфекционный генез ранних ПР. В более поздние сроки такой тенденции не отмечалось. Возможно, поэтому в проведенных нами исследованиях на сроках беременности 28–33 недели 6 дней и 34–36 недели 6 дней выявлялся только повышенный уровень IL-8 в основной группе. При изучении внеклеточной ДНК нами установлено, что при ПР на всех сроках достоверно повышена овДНК, и только на сроке 28–33 недели 6 дней повышена пвДНК. В других исследованиях отмечается роль пвДНК в наступлении ПР [13, 19]. Учитывая, что на сроке беременности 28–33 недели 6 дней основная и контрольная группы достоверно не различались по реализации внутриутробной инфекции, можно предположить, что только в данной группе важную роль в развитии ПР играла пвДНК. В другие сроки беременности отмечался повышенный уровень овДНК и достоверно большая частота внутриутробной инфекции в основной группе.

В литературе представлены диагностические модели для прогнозирования ПР, основанные на определении цитокинов или внеклеточной ДНК в крови матери, которые не обладают достаточной предсказательной способностью [17]. Разработанное комбинированное определение овДНК, пвДНК и цитокинов позволяет создать модель с высокой прогностической ценностью. Вместе с тем, следует отметить, что применение метода логистической регрессии при одновременном определении цитокинов и внеклеточной ДНК позволило получить диагностические модели прогнозирования ПР, различные для каждого срока беременности.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование показывает, что комбинированное определение внеклеточной ДНК и цитокинов является перспективным подходом для прогнозирования ПР.

Список литературы

  1. Сухих Г.Т., Серов В.Н., Адамян Л.В., Филиппов О.С., Баев О.Р., Клименченко Н.И., Тетруашвили Н.К., Тютюнник В.Л., Ходжаева З.С., Холин А.М.Преждевременные роды. Клинические рекомендации (протокол). М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации; 2014. 35с.
  2. Hadži-Lega M., Markova A.D., Stefanovic M., Tanturovski M. Interleukin 6 and fetal fibronectin as a predictors of preterm delivery in symptomatic patients. Bosn. J. Basic Med. Sci. 2015; 15(1): 51-6.
  3. Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В., ред. Иммунология. Практикум. Учебное пособие. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2012. 176с.
  4. Suryanegara K., Kawilarang S. Difference of maternal serum interleukin-8 in preterm labor and normal pregnancy. Med. J. Obstet. Gynecol. 2017; 5(4): 1108.
  5. Савельева Г.М., Шалина Р.И., Курцер М.А., Клименко П.А., Сичинава Л.Г., Панина О.Б., Плеханова Е.Р., Выхристюк Ю.В., Лебедев Е.В. Преждевременные роды как важнейшая проблема современного акушерства. Акушерство и гинекология. 2012; 8-2: 4-10.
  6. Bogavac M., Brkić S., Celić D., Simin N., Matijasević J., Ilić T. Interferon gamma, interleukin 8 and interleukin 10 in serum of patients with the cervical infection and symptoms of the imminent preterm delivery. Srp. Arh. Celok. Lek. 2013; 141(9-10): 623-8.
  7. Szpecht D., Gadzinowski J., Nowak I., Cygan D., Seremak-Mrozikiewicz A., Kurzawińska G. et al. The significance of IL-1β +3953C>T, IL-6 -174G>C and -596G>A, TNF-α -308G>A gene polymorphisms and 86 bp variable number tandem repeat polymorphism of IL-1RN in bronchopulmonary dysplasia in infants born before 32 weeks of gestation. Cent. Eur. J. Immunol. 2017; 42(3): 287-93.
  8. Chaemsaithong P., Romero R., Korzeniewski S.J., Martinez-Varea A., Dong Z., Yoon B.H. et al. A rapid interleukin-6 bedside test for the identification of intra-amniotic inflammation in preterm labor with intact membranes. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2016; 29(3): 349-59.
  9. Romero R., Grivel J.C., Tarca A.L., Chaemsaithong P., Xu Z., Fitzgerald W. et al. Evidence of perturbations of the cytokine network in preterm labor. Am. J. Obstet. Gynecol. 2015; 213(6): 836. e1-836. e18.
  10. Illanes S., Gomez R., Fornes R., Figueroa-Diesel H., Schepeler M., Searovic P. et al. Free fetal DNA levels in patients at risk of preterm labour. Prenat. Diagn. 2011; 31(11): 1082-5.
  11. Quezada M.S., Francisco C., Dumitrascu-Biris D., Nicolaides K.H., Poon L.C. Fetal fraction of cell-free DNA in maternal plasma in the prediction of spontaneous preterm delivery. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2015; 45(1): 101-5.
  12. Jakobsen T.R., Clausen F.B., Rode L., Dziegiel M.H., Tabor A. High levels of fetal DNA are associated with increased risk of spontaneous preterm delivery. Prenat. Diagn. 2012; 32(9): 840-5.
  13. Dugoff L., Barberio A., Whittaker P.G., Schwartz N., Sehdev H., Bastek J.A. Cell-free DNA fetal fraction and preterm birth. Am. J. Obstet. Gynecol. 2016; 215(2): 231. e1-7.
  14. József L., Khreiss T., El Kebir D., Filep J.G. Activation of TLR-9 induces IL-8 secretion through peroxynitrite signaling in human neutrophils. J. Immunol. 2006; 176(2): 1195-202.
  15. Dhallan R., Au W.C., Mattagajasingh S., Emche S., Bayliss P., Damewood M. et al. Methods to increase the percentage of free fetal DNA recovered from the maternal circulation. JAMA. 2004; 291(9): 1114-9.
  16. Chan K.C., Ding C., Gerovassili A., Yeung S.W., Chiu R.W., Leung T.N. et al. Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clin. Chem. 2006; 52(12): 2211-8.
  17. Красный А.М., Грачева М.И., Садекова А.А., Вторушина В.В., Балашов И.С., Кан Н.Е., Боровиков П.И., Кречетова Л.В., Тютюнник В.Л. Комбинированное исследование общей, фетальной ДНК, цитокинов в плазме крови матери при преэклампсии. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2017; 164(12): 686-91.
  18. Arababadi M.K., Aminzadeh F., Hassanshahi G., Khorramdelazad H., Norouzi M., Zarandi E.R. et al. Cytokines in preterm delivery. Lab. Med. 2012; 43(4): 27-30.
  19. Scharfe-Nugent A., Corr S.C., Carpenter S.B., Keogh L., Doyle B., Martin C. et al. TLR9 provokes inflammation in response to fetal DNA: mechanism for fetal loss in preterm birth and preeclampsia. J. Immunol. 2012; 188(11): 5706-12.

Поступила 13.04.2018

Принята в печать 20.04.2018

Об авторах / Для корреспонденции

Красный Алексей Михайлович, к.б.н., заведующий лабораторией цитологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес:
117997, г. Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (495) 438-22-72. E-mail: alexred@list.ru
Кан Наталья Енкыновна, д.м.н., заведующая акушерским отделением ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, г. Москва ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (926) 220-86-55.
E-mail: kan-med@mail.ru. Номер Researcher ID B-2370-2015. ORCID ID 0000-0001-5087-5946
Тютюнник Виктор Леонидович, д.м.н., заведующий 1-ым акушерским физиологическим отделением ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (903) 969-50-41.
E-mail: tioutiounnik@mail.ru. Номер Researcher ID B-2364-2015.ORCID ID 0000-0002-5830-5099
Садекова Алсу Амировна, научный сотрудник лаборатории цитологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (495) 438-22-72. E-mail: a_sadekova@oparina4.ru
Сарибекова Алена Гарриевна, аспирант ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика
В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (926) 551-78-24. E-mail: arushanovaa@mail.ru
Кокоева Диана Николаевна, аспирант ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика
В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (937) 267-44-40. E-mail: dikokoeva@mail.ru
Салпагарова Залина Хусеевна, аспирант ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика
В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (925) 853-96-22. E-mail: z.salpagarova1990@yandex.ru
Меджидова Маржанат Капуровна, докторант ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (926) 381-17-10. E-mail: marzhana-m@yandex.ru
Вторушина Валентина Валентиновна, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики лаборатории иммунологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: v_vtorushina@oparina4.ru
Кречетова Любовь Валентиновна, к.м.н., заведующая лабораторией иммунологии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, дом 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: l_krechetova@oparina4.ru

Для цитирования: Красный А.М., Кан Н.Е., Тютюнник В.Л., Садекова А.А., Сарибекова А.Г., Кокоева Д.Н., Салпагарова З.Х., Меджидова М.К., Вторушина В.В., Кречетова Л.В. Прогнозирование преждевременных родов путем комбинированного определения цитокинов и внеклеточной ДНК. Акушерство и гинекология. 2019; 1: 86-91.
http: // dx.doi.org/10.18565/aig.2019.1.86-91

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь
Статьи по теме

Смотрите также