Противоопухолевые эффекты Аквадетрима водного раствора мицелл с витамином D

30.12.2015
727

(1) ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, Иваново; (2) ГБАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет)» Минобрнауки, Долгопрудный; (3) Национальный медицинский исследовательский радиологический центр Минздрава РФ, Обнинск

Представлены результаты исследования противоопухолевого действия водного раствора мицелл с витамином D (препарат Аквадетрим) на рост и метастазирование злокачественных новообразований у 50 мышей-гибридов F1.. В качестве опухолевой модели использована перевиваемая эпидермоидная карцинома легких Льюис (КЛЛ). Препарат Аквадетрим, действующим началом которого является витамин D в водном растворе мицелл, достоверно подавляет процессы метастазирования КЛЛ, относящейся к списку опухолевых систем, обязательных для изучения при доклинических исследованиях потенциальных противоопухолевых и антиметастатических средств.

Введение

По сравнению со взрослыми общая заболеваемость злокачественными опухолями у детей относительно невелика. Например, по данным Госкомстата на 2014 г. (http://www.gks.ru), показатель распространенности злокачественных новообразований в 2014 г. составил 2241 случай на 100 тыс. населения (с учетом Крымского федерального округа – 2250 случаев), что выше уровня 2004 г. на 39% (в 2009 г. – 1625 случаев на 100 тыс. населения).

В то же время в 2014 г. заболеваемость среди детей составила примерно 12 случаев на 100 тыс. детей (т.е. почти в 190 раз меньше, чем у взрослых). Тем не менее эта проблема остается весьма актуальной, ведь в России ежегодно выявляется 2,3–2,9 тыс. детей со злокачественными опухолями.

Онкологи неоднократно изучали факторы, которые влияют на развитие злокачественных новообразований у детей и подростков: материнское и отцовское курение до зачатия ребенка, аборты в анамнезе, патологии беременности (токсикоз, отечный синдром, угроза прерывания, внутриутробная гипоксия). Наличие внутриутробной инфекции во время беременности (цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, герпес, хламидиоз, микоплазмоз и др.) ассоциировано почти с 10-кратным повышением риска опухолевых заболеваний у детей [1, 2].

Особую роль в патогенезе опухолевых заболеваний играет дефицит витаминов и микроэлементов, прежде всего недостаточность витамина D. Витамин D – гормон, необходимый для нормального функционирования многих физиологических систем организма, в частности для поддержания противоопухолевой защиты организма. Противоопухолевый эффект витамина D основан на прямом влиянии витамина на транскрипцию более 3000 генов, вовлеченных в регуляцию роста, деления и апоптоза клеток [3]. Поддержка витамином D процессов апоптоза (программированной клеточной смерти) чрезвычайно важна для элиминации опухолевых клеток из организма ребенка с высокой восприимчивостью к опухолевым заболеваниям. На основе системно-биологического анализа противоопухолевых эффектов витамина D была сформулирована модель связи между риском опухолевых заболеваний и витамином D (рис. 1) [4].

Противоопухолевый эффект витамина D3 обусловлен активностью активированного рецептора витамина D3 VDR (vitamin D-receptor), который экспрессируется во многих клетках иммунной системы: моноцитах, макрофагах, Т-лимфоцитах и В-лимфоцитах. Активация транскрипции посредством VDR в этих и других типах клеток имеет антипролиферативный и иммуномодулирующий эффекты [5]. Принимая во внимание, что внутриутробная инфекция служит важным фактором риска опухолевых заболеваний, важно отметить потенцирование витамином D антибактериального и антивирусного иммунитета. В клинической практике было отмечено, что при применении витамина D с целью лечения рахита дети, часто болевшие респираторными заболеваниями, болели существенно реже. Установлена роль витамина D в профилактике и лечении инфекционных заболеваний [6]: хронического ринита и риносинусита [7], гриппа [8], вирусного гепатита С и др.

Говоря о взаимосвязи обеспеченности организма витамином D и риском развития раковых заболеваний, важно подчеркнуть, что повсеместно упоминаемый рефрен «синтез витамина D в коже под действием солнечных лучей» является с практической точки зрения не более чем красивым сценарием фантастического фильма. Однако такого рода фантастический сценарий для профилактики дефицита витамина D у детей не вполне научен, особенно в нашей стране [9].

Действительно, при достаточном облучении открытой поверхности кожи ультрафиолетовым излучением спектра «В» (УФ-В, длина волны 290–315 нм) в мальпигиевом и базальном слоях эпидермиса происходит синтез витамина D3 (холекальциферол) из 7-дегидрохолестерола (превитамин D). Синтез осуществляется в результате неферментативной реакции за счет фотолиза и термической изомеризации 7-дегидрохолестерола. Образовавшийся в эпидермисе холекальциферол связывается с витамин D-связывающим белком и затем поступает в кровоток.

Этот общеизвестный сценарий подтверждается данными достоверных биохимических и клинических исследований. В то же время данный сценарий не является практическим способом компенсации дефицита витамина D в организме ребенка, что особенно очевидно по отношению к России. При сочетании неблагоприятных факторов (недостаточная интенсивность излучения УФ-В, темный цвет кожи, высокая облачность, смог, использование солнцезащитных кремов, гиподинамия и т.д.) синтеза витамина D в коже под действием солнечного излучения практически не происходит [9]. Рассмотрим соответствующие аргументы более подробно.

Во-первых, бо́льшая часть территории России расположена в зоне низкой инсоляции и большинство населенных пунктов характеризуются малым числом солнечных дней в году (40–70 дней).

Во-вторых, для синтеза витамина D необходим не просто солнечный свет, а излучение спектра УФ-В, которое достигает поверхности Земли далеко не во всех регионах страны.

В-третьих, интенсивность УФ-В, достаточная для синтеза витамин D, наблюдается только в определенное время суток (как правило, с 11.00 до 14.00).

В-четвертых, при повышенной облачности, тумане, загрязненности воздуха и др. интенсивность синтеза витамина D3 в коже падает до нуля. Кроме того, солнечный свет спектра УФ-В не проникает через стекло, одежду и солнцезащитный крем, который повсеместно используется для защиты кожи ребенка в летнее время.

В-пятых, активность процесса синтеза витамина D3 в коже находится в обратной зависимости от степени пигментации кожи. Этот хорошо известный факт далеко не всегда полностью осознается. Например, у ребенка с исходно светлой кожей синтез витамина D постепенно падает по мере усиления загара. Все дети с темным цветом кожи составляют особую группу пациентов, у которых синтез витамина D3 в коже минимален и повышен риск дефицита витамина D.

В-шестых, достаточно активный переход синтезированного витамина D из эпидермиса в кровоток происходит только при активной физической нагрузке. Гиподинамия существенно снижает поступление синтезируемого в коже холекальциферола в кровеносное русло. Кроме того, на фоне гиподинамии снижаются эффекты воздействия витамина D на обмен кальция [9].

Поэтому наиболее эффективным методом компенсации дефицита витамина D остается использование специальных препаратов витамина, характеризующихся высокой биоусвояемостью. Сопоставление результатов системно-биологического анализа противоопухолевых эффектов витамина D3 [10] с данными доказательной медицины подтверждает клиническое значение использования дотаций витамина D3 для сокращения заболеваемости раком (все виды рака) [10]. Имеющиеся данные доказательной медицины показывают, что долговременный прием витамина D3 в дозировках 800… 3000 МЕ/сут достоверно снижает риск рака молочной железы [11], толстого кишечника [12] и смертность от всех видов рака.

Например, мета-анализ 28 наблюдательных исследований показал, что увеличение уровней 25(ОН)D в крови на каждые 10 нмоль/л связано с 6%-ным (95% доверительный интервал [ДИ] – 3–9%) снижением риска рака толстого кишечника [12]. Систематический обзор проспективных исследований взаимодействий между витамином D и риском рака толстого кишечника включил 18 исследований и более 1 млн участников из европейских стран. Самый высокий квартиль потребления витамина D соответствовал снижению риска на 12% (относительный риск [ОР]=0,88, 95% ДИ – 0,80–0,96); самый высокий квартиль уровней 25(ОН) D – снижению риска на 33% (ОР=0,67, 95% ДИ – 0,54–0,80).

Витамин D в виде водного раствора мицелл является одной из перспективных фармакологических форм для длительного применения витамина D. В физической химии мицеллы (от лат. mica – крупинка) – частицы коллоидных систем, образующие мелкодисперсную взвесь в большом объеме растворителя. Мицеллообразование играет ключевую роль для усвоения витамина D из пищевых продуктов и фармакологических препаратов. Мицеллы – наночастицы (10… 1000 нм в диаметре) с «жировой» начинкой, содержащей витамин D, и гидрофильной оболочкой, которая позволяет им равномерно распределяться по всему объему водного раствора. Именно за счет образования мицелл происходит «солюбилизация» витамина D (т.е. перевод витамина в водорастворимую форму за счет образования мицелл) [13].

В настоящей работе исследованы эффекты мицеллированной формы витамина D на рост и метастазирование злокачественных новообразований перевиваемой карциномы легких Льюис (КЛЛ). Выбор модели обусловлен отчасти тем, что заболевания легких являются одними из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований в России: в 2014 г., как и в предшествующие годы, наиболее часто встречались новообразования кожи (14% от числа новых случаев рака), молочной железы (12%) и трахеи, бронхов, легкого (10%) [14]. В качестве препарата витамина D был использован Аквадетрим – водный раствор мицелл, содержащих витамин D.

Материал и методы

Исследования проведены на 50 самцах мышей-гибридов F1 (CBA×C57Bl6) в возрасте 2,5–3,0 месяцев с массой тела 26–29 г. Животные были получены из питомника ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (филиал «Андреевка») и имели ветеринарный сертификат. Содержались животные в клетках Т-3 в соответствии с нормами группового размещения [15] в условиях естественного освещения с принудительной 16-кратной вентиляцией при температуре 18–20°C и относительной влажности воздуха 40–70% на подстилке из простерилизованных древесных стружек. Животные имели свободный доступ к питьевой воде и корму и получали стандартный (ГОСТ Р50258-92) брикетированный корм ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», Россия). Все работы с лабораторными животными были выполнены на основе стандартных операционных процедур, принятых в МРНЦ, соответствующих правилам Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для научных целей [16].

В качестве опухолевой модели использована перевиваемая эпидермоидная с КЛЛ, относящаяся к списку опухолевых систем, обязательных к изучению при доклинических исследованиях потенциальных противоопухолевых и антиметастатических средств [17]. Штамм КЛЛ был получен из банка опухолевых материалов ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина и поддерживался на самцах мышей С57BL6j. Для перевивки опухолевую ткань, взятую на 14-е сутки роста, измельчали до гомогенной консистенции, гомогенат фильтровали с помощью нейлонового фильтра с порами 40 мкм, оценивали клеточность суспензии в камере Горяева под микроскопом Olympus (Япония) и доводили средой 199 (Пан-Эко, Россия) до концентрации 1,9×107 кл/мл. Перевивку КЛЛ проводили путем подкожного введения 0,1 мл суспензии (1,9×106 клеток) на внешней поверхности правого бедра.

После перевивки КЛЛ мыши были распределены в три экспериментальные группы – контрольную (20 особей) и две опытные (по 15 особей в каждой). Животные контрольной группы в дальнейшем не подвергались никаким воздействиям. Животным первой опытной группы со 2-х по 20-е сутки после перевивки КЛЛ ежедневно, однократно, интрагастрально вводили раствор Аквадетрима в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела (в расчете 5 мкг/кг/сут).

В ходе эксперимента ежедневно оценивали общее состояние животных, их поведенческие реакции, двигательную активность, потребление корма и воды и через каждые 3–4 суток измеряли массу тела подопытных мышей.

Влияние изучаемого препарата на рост и метастазирование КЛЛ оценивали морфологическими методами [10]. Для этого на 7-е, 10, 13, 17 и 21-е сутки после перевивки КЛЛ всем животным проводили измерение линейных размеров опухолевых узлов в ортогональных плоскостях и рассчитывали их объемы в эллиптическом приближении. В дальнейшем проводили статистическую проверку межгрупповых различий объемов опухоли на различных этапах роста и рассчитывали значения индекса торможения роста опухоли.

Животных выводили из опыта на 2-е сутки после перевивки КЛЛ методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Выделяли легкие, фиксировали их 24 часа в жидкости Буэна и подсчитывали на их поверхности число малых и крупных метастазов. Далее проводили статистическую проверку межгрупповых различий числа легочных метастазов и проводили расчет индекса ингибирования метастазирования.

Начиная с 7–8-х суток экспериментов, когда опухолевые узлы достигали измеряемого размера, каждые 2–3 дня у всех животных измеряли линейные размеры опухолей и рассчитывали их объемы в эллиптическом приближении:

где V – объем опухоли (мм3); χ, γ, z – ортогональные линейные размеры (мм).

В дальнейшем строили кривые опухолевого роста, рассчитывали индексы торможения роста опухоли или индексы их роста на различных сроках наблюдения:

где ТРО – индекс торможения роста опухоли, ИР – индекс роста опухоли, VΚ и Vо – средние объемы опухоли в контрольной и подопытной группах на определенном сроке наблюдения, а также по экспоненциальным кривым роста оценивали длительность задержки роста новообразований, по которым судили о противоопухолевом действии [12].

Выводили животных из опыта на 21-е сутки после перевивки опухоли путем цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Выделяли легкие, фиксировали их 24 часа в жидкости Буэна, проводили подсчет числа малых и крупных легочных метастазов КЛЛ и рассчитывали индексы ингибирования метастазирования:

где ИИМ – индекс ингибирования метастазирования, fо, fΚ – доля животных с метастазами в подопытной и контрольной группах, Мо, МΚ – среднее число метастазов в подопытной и контрольной группах [18], по которым судили об антиметастатическом действии изучаемых соединений.

Значимость межгрупповых различий оценивали путем рангового дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса с использованием критерия Данна, t-теста, а также с использованием непараметрических критериев А.Н. Колмогорова и Н.В. Смирнова. Во всех случаях различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Экспериментальное исследование препарата Аквадетрим показало, что подопытные животные с КЛЛ легко переносили препарат. Ежедневное интрагастральное введение препарата Аквадетрим не сопровождалось какими-либо симптомами интоксикации и изменениями в общем состоянии, возбудимости и двигательной активности подопытных животных. Не было установлено и влияния изучаемого препарата на изменение массы тела животных (табл. 1).

Развитие КЛЛ в контрольной группе в данном эксперименте в целом имело типичный для этой опухолевой системы характер – к 7-м суткам после перевивки опухолевый узел определялся у 100% животных и имел объем 70 мм3. Статистически значимого влияния на рост КЛЛ изучаемый препарат не оказывал на протяжении всей длительности эксперимента (табл. 2).

В то же время следует отметить, что воздействие препарата до 13-х суток развития КЛЛ сопровождалось нарастающей тенденцией торможения роста опухоли – индекс торможения роста опухоли возрастал до 25–30% (табл. 3).

Анализ пучка индивидуальных кривых скорости роста опухолей подтвердил достоверные различия между опытной и контрольной группами до 13 суток (рис. 2).

К 10-м суткам эксперимента отмечена тенденция (р=0,09) к снижению скорости роста опухоли, а к 13-м – достоверное снижение интенсивности роста опухолей (р=0,016; рис. 3).

Достоверность различий в скорости роста опухолей на 13-е сутки была подтверждена и другим статистическим тестом – непараметрическим тестом А.Н. Колмогорова. Значение максимального уклонения (D) между распределениями, построенными для групп «случай» и «контроль», на 13-е сутки составило D=0,36 (что соответствовало достоверным различиям; р=0,033, рис. 4).

Более выраженным было антиметастатическое действие Аквадетрима (табл. 4). На рост метастазов, как и на рост первичной опухоли, изучаемый препарат не влиял – число крупных метастазов в опытных группах не отличалось от контроля. Вместе с тем в группе животных, получавших Аквадетрим, наблюдались отчетливые признаки подавления процессов метастазирования: статистически значимое снижение числа малых метастазов, индекс ингибирования метастазирования достигал 35–40% (рис. 5).

Выводы

В настоящей работе показано, что пероральное введение препарата Аквадетрим тормозит интенсивность роста перевиваемой КЛЛ и достоверно подавляет процессы метастазирования опухолей этого вида. Антиметастатическое воздействие витамина D, входящего в состав препарата Аквадетрим, вполне закономерно. Считается, что риск развития больше чем одной опухоли связан с факторами окружающей среды, питания и генетики организма [19]. Среди других известных причин – иммунодефицитные состояния, на фоне которых и развиваются вторая и последующие злокачественные опухоли [20].

Витамин D является доказанным стимулятором противоопухолевого иммунитета, который компенсирует иммунодефицитные состояния, способствующие метастазированию.

Список литературы

  1. Kufe D.W., Pollock R.E., Weichselbaum R.R., et al. (eds). Holland-Frei Cancer Medicine. 6th edition. Hamilton (ON): BC Decker, 2003.
  2. Детская онкология. Национальное руководство / Под ред. М.Д. Алиева, В.Г. Полякова, Г.Л. Менткевича, С.А. Маяковой. М., 2012. 684 с.
  3. Ingraham B.A., Bragdon B., Nohe A. Molecular basis of the potential of vitamin D to prevent cancer. Curr. Med. Res. Opin. 2008;24(1):139–49.
  4. Громова О.А., Торшин И.Ю., Малыгин С.Е., Лиманова О.А., Гилельс А.В. О противо-опухолевом эффекте препаратов витами-на D3: фундаментальные исследования и доказательная медицина. Фарматека. 2014;19:48–58.
  5. Torshin I.Yu. Bioinformatics in the post-genomic era: physiology and medicine. Nova Biomedical Books, NY, USA. 2007. P. 35–67.
  6. Dini C., Bianchi A. The potential role of vitamin D for prevention and treatment of tuberculosis and infectious diseases. Ann. Ist. Super Sanita. 2012;48(3):319–27.
  7. Abuzeid W.M., Akbar N.A., Zacharek M.A. Vitamin D and chronic rhinitis. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2012;12(1):13–7.
  8. Sundaram M.E., Coleman L.A. Vitamin D and influenza. Adv. Nutr. 2012;3(4):517–25.
  9. Громова О.А., Торшин И.Ю., Захарова И.Н., Спиричев В.Б. О дозировке витамина D у детей и подростков. Вопросы современной педиатрии. 2015;1:63–7.
  10. Westerdahl J., Ingvar C., Masback A., Jonsson N., Olsson H. Risk of cutaneous malignant melanoma in relation to use of sunbeds: further evidence for UV-A carcinogenicity. Br. J. Cancer. 2000;82(9):1593–99.
  11. W.ang D, Velez de-la-Paz O.I., Zhai J.X, Liu D.W. Serum 25-hydroxyvitamin D and breast cancer risk: a meta-analysis of prospective studies. Tumour Biol. 2013;34(6):3509–17.
  12. Chung M., Lee J., Terasawa T., Lau J., Trikalinos T.A. Vitamin D with or without calcium supplementation for prevention of cancer and fractures: an updated meta-analysis for the U.S. Preventive Services Task Force. Ann. Intern. Med. 2011;155(12):827–38.
  13. Громова О.А., Торшин И.Ю., Пронин А.В. Особенности фармакологии водораст-воримой формы витамина D на основе мицелл. Фарматека. 2015;1:28–35.
  14. Скворцова В.И. Доклад о состоянии здоровья населения и организации здравоохранения по итогам деятельности органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации за 2014 год. 18 июня 2015.
  15. Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики».
  16. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123). Strasbourg, 1986.
  17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М., 2012. 944 с.
  18. Хабриев Р.У. Руководство по экспе-риментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2-e изд., перераб. и доп. М., 2005. 832 с.
  19. Сельчук В.Ю. Первично-множественные злокачественные опухоли (клиника, лечение и закономерности развития). Дисс. докт. мед. наук. М. 1994.
  20. Ханов А.М. Первично-множественные опухоли. Общая онкология. URL:http://notemed.com/itemlist/category/5323-obshchaya-onkologiya.html.

Об авторах / Для корреспонденции

О.А. Громова – д.м.н., проф. кафедры фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, Иваново; тел. 8 (4932) 41-65-25, 8 (84932) 30-17-66; e-mail: unesco.gromova@gmail.com
А.В. Пронин – аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, Иваново; тел. 8 (4932) 41-65-25
Т.Р. Гришина – д.м.н., зав. кафедрой фармакологии ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздрава РФ, Иваново; тел. 8 (4932) 41-65-25, 8 (84932) 30-17-66
И.Ю. Торшин – к.ф-м.н., доцент кафедры интеллектуальные системы ГБАОУ ВПО «Московский физико-технический институт (государственный университет)» Минобрнауки, Долгопрудный; тел. 8 (499) 135-24-89
М.В. Филимонова – к.м.н., доцент, Национальный медицинский исследовательский радиологический центр Минздрава РФ, Обнинск

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь