Разработка тест-системы для определения РНК вируса Кемерово в формате ПЦР в режиме реального времени

01.09.2012
1023

ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва; ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Москва; ФГБУ НИИ медицины труда РАМН, Москва

Цель исследования. Разработка тест-системы в формате ПЦР в реальном времени для определения РНК вируса Кемерово в различных типах исследуемого материала.
Материалы и методы. В качестве мишени выбран фрагмент нуклеотидной последовательности гена полимеразы. Для детекции разработан зонд типа TaqMan.
Результаты. Впервые разработана тест-система в формате ПЦР в режиме реального времени для определения РНК вируса Кемерово.
Заключение. С помощью разработанной тест-системы планируется определение базовых эпидемиологических характеристик вируса Кемерово на территории РФ.

Вирус Кемерово впервые выделен в 1962 г. из клещей Ixodes рersulcatus и ликвора больного человека в ходе экспедиции в Кемеровскую область под руководством акад. М. П. Чумакова. В процессе изучения вируса было установлено его отличие от вируса клещевого энцефалита, в напряженном очаге которого был обнаружен новый инфекционный агент. Затем была доказана его антигенная самостоятельность. По предложению М. П. Чумакова новый вирус был назван вирусом Кемерово [1].

Вирус Кемерово является представителем семейства Reoveridae рода Orbivirus. Геном представлен двухнитевой РНК, состоящей из 10 сегментов размером от 700 до 4000 пар оснований. Общий размер генома составляет 20 000 пар оснований.

По существующим представлениям лихорадка, вызываемая вирусом Кемерово, считается природноочаговой инфекцией с трансмиссивным механизмом передачи и отнесена ко II группе патогенности. [2]. Резервуаром вируса в природе являются птицы, переносчиком – иксодовые клещи. Естественная восприимчивость людей к вирусу высокая, после заболевания остается гуморальный, преимущественно типоспецифический иммунитет. Клиническая картина кемеровской лихорадки развивается через 4–5 дней после присасывания зараженного клеща. Дебют заболевания протекает остро, с подъемом температуры до 39–40 ˚С. Отмечается инъекция склер и конъюнктивы, появление пятнисто-папулезной либо мелкоточечной сыпи. Возможно развитие миокардита и менингоэнцефалита. Заболевание кемеровской лихорадкой регистрировали на территории Западной Сибири. Для лабораторной диагностики использовали методы РЕК (реакция связывания комплемента), РТГ (реакция торможения гемагглютинации), РН (реакция нейтрализации) в парных сыворотках, взятых в первые дни и на 2–4-й неделе. В настоящее время диагностика кемеровской лихорадки не проводится, так как инфекция перешла в разряд «забытых». ПЦР и ИФА-диагностикумы не разработаны.

Несмотря на то что вирус Кемерово был открыт 50 лет назад, до сих пор не описаны его базовые эпидемиологические характеристики. Остается открытым вопрос о возможном вкладе кемеровской лихорадки в структуру заболеваемости лихорадками неясного генеза после присасывания клеща.

Для изучения распространенности вируса Кемерово на территории РФ нами впервые была разработана тест-система в формате ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять РНК вируса как в полевом, так и в клиническом материале. В состав тест-системы входят набор для выделения нуклеиновых кислот Рибо-Преп [ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦНИИЭ)], набор для обратной транскрипции Reverta-L (ЦНИИЭ) и набор для проведения амплификации в формате ПЦР в режиме реального времени для определения кДНК вируса Кемерово.

Материалы и методы

В качестве мишени для олигонуклеотидных праймеров и флюоресцентного зонда был выбран ген полимеразы, представляющий собой наименее вариабельный участок генома.

Дизайн праймеров и зонда проводили на основании первичной нуклеотидной последовательности гена полимеразы вируса Кемерово, представленной в международной базе данных NCBI (Национальный центр биотехнологической информации, HM543481) [3], и с учетом общих требований, предъявляемых к олигонуклеотидным праймерам и зондам типа TaqMan при проектировании тест-систем в формате ПЦР в режиме реального времени [4–6]. Оценку температуры плавления праймеров рассчитывали с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/OligoCalc.html). Термодинамические характеристики зонда и возможность образования вторичных структур оценивали с помощью программ Oligonucleotide Properties Calculator и MFOLD (http://mfold.rna.albany.edu/). При синтезе зонда в качестве флюорофора использовали R6G (крезилвиолет), а в качестве тушителя – BHQ-1 (black hole quencher1).

Аналитическую чувствительность набора для проведения ПЦР в режиме реального времени оценивали методом лимитирующих разведений. В качестве мишени использовали рекомбинантный фрагмент ДНК, содержащий искомую матрицу. Для этого клонировали соответствующий фрагмент ДНК в плазмиду pGem (Promega) содержащую ген ампициллиновой устойчивости – β-лактамазу [7]. Концентрацию полученного контрольного образца определяли с помощью комплекта реагентов CQS-Bla (ЦНИИЭ), содержащего праймеры и зонд к гену bla, кодирующему β-лактамазу. Последовательно готовили разведения контрольного образца с шагом 10.

Для оценки аналитической чувствительности тест-системы методом лимитирующих разведений и создания положительного контрольного образца (ПКО) использовали рекомбинантную РНК на основе MS2-фага в защитной белковой оболочке с целевой вставкой 600 пар оснований [8, 9]. Концентрацию рекомбинантной РНК (ПКО) оценивали с помощью комплекта реагентов CQS-gag (ЦНИИЭ). Последовательно готовили разведения ПКО с шагом 10. Далее проводили ПКО через процедуру выделения с помощью набора Рибо-Преп (ЦНИИЭ) и после обратной транскрипции (ОТ) с использованием набора Reverta-L (ЦНИИЭ) амплифицировали с помощью набора для определения кДНК вируса Кемерово в формате ПЦР в режиме реального времени.

Специфичность тест-системы оценивали, используя коллекцию из 11 изолятов вируса Кемерово, полученных в период с 1963 по 1971 г., 2 изолятов вируса Трибеч (семейство Reoveridae), полученных в 2005 г., и 100 образцов ДНК, выделенных из крови.

Для апробации тест-системы на полевом материале анализировали 329 образцов кДНК из клещевых суспензий Ixodes persulcatus, собранных в Кемеровской области в 2005 г.

Реакцию ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени Rotor Gene 3000 («Corbett Researh», Австралия).

Реакционную смесь, содержащую 5 пмоль праймера rt_Kem-4f, 5 пмоль праймера rt_Kem-4r, 3 пмоль зонда Kem-prb4, 2,5 мкл 1,76 мМ дНТФ(Т) (ЦНИИЭ), 7 мкл смеси для ПЦР Flu-2 (ЦНИИЭ), доводили H2O (milliQ) до 23 мкл и добавляли 2 мкл ОТ-смеси, содержащей кДНК исследуемых образцов. Режим амплификации представлен в табл. 1.

Таблица 1.

Результаты ПЦР подтверждали секвенированием полученного ПЦР-продукта для каждого изолята вируса Кемерово и положительных образцов из полевого материала. Секвенирование проводили с помощью системы автоматического секвенирования GA 3100 («Applied Biosystems», США).

Результаты и обсуждение

Структура и характеристики праймеров и зонда для обнаружения кДНК вируса Кемерово предсталены в табл. 2.

Таблица 2.

При оценке специфичности тест-системы ложноположительных результатов не выявлено. При этом все образцы кДНК из изолятов вируса Кемерово детектировались как положительные (рис. 1). Аналитическая чувствительность набора для определения кДНК вируса Кемерово, определенная методом конечных разведений, составила 103 геномных эквивалентов рекомбинантной ДНК вируса Кемерово в 1 мл. Аналитическая чувствительность тест-системы при этом составила 2,5•10³ геномных эквивалентов рекомбинантной РНК в 1 мл.

Рисунок 1.

Анализ подтверждающих сиквенсов показал наличие искомого ампликона в ПЦР-продуктах из положительных образцов. Особенности вторичной структуры зонда позволили добиться 8-кратного разгорания за счет снижения уровня фоновой флюоресценции (рис. 2).

Рисунок 2.

При тестировании образцов кДНК из полевого материала (клещевых суспензий) было выявлено 5 положительных образцов, что составило 1,5 % от исследуемой выборки. Полученные данные хорошо согласуются с представленными в литературе [1, 10, 11], согласно которым в разные годы на территории Кемеровской области зараженность клещей вирусом Кемерово составляла от 0,7 до 2,5%. Однако полученные нами результаты нуждаются в уточнении. Это обусловлено рядом причин. Во-первых, данные о распространенности вируса Кемерово относятся к 70-м годам прошлого века и не обновлялись, так как в настоящее время эпидемиологический надзор за вирусом не осуществляется. Во-вторых, зараженность клещей изучалась посредством вирусологических методов, чувствительность которых существенно уступает методу ПЦР в режиме реального времени. В-третьих, выбор праймеров и зонда для тест-системы осуществлялся на основании лишь одной представленной в открытых источниках первичной нуклеотидной последовательности вируса, изолят которого получен в 1962 г. За последующие 50 лет вирус мог претерпеть существенные эволюционные изменения, что могло привести, в частности, к появлению замен в области посадки праймеров и зонда и, таким образом, снизить чувствительность тест-системы.

Таким образом, разработанная тест-система для детекции РНК вируса Кемерово в формате ПЦР в режиме реального времени обладает высокой специфичностью и чувствительностью. Наличие такого современного и высокоточного инструмента впервые позволит проводить широкомасштабные эпидемиологические исследования с целью определения базовых эпидемиологических характеристик вируса Кемерово как на территории РФ, так и за ее пределами.

Авторы выражают признательность Дмитрию Александровичу Дубине (Украинский НИИ противочумный институт им. Мечникова Минздрава Украины) за любезно предоставленные образцы РНК вируса Трибеч.

Список литературы

Литература
1. Михайлова И.С. Материалы изучения природных очагов вируса Кемерово и его роли в патологии человека. Дис... канд. мед. наук, М., 1974.
2. Черкасский Б.Л. Особо опасные инфекции. М.: Медицина, 1996.
3. Belhouchet M., Mohd J. F., Tesh R.B. et al. Complete sequence of Great Island virus and comparison with the T2 and outercapsid proteins of Kemerovo, Lipovnik and Tribec viruses
genus Orbivirus, family Reoviridae. J. Gen. Virol. 2010; 91(12): 2985–2993.
4. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat. Biotechnol. 1996; 14: 303–308.
5. van Pelt-Verkuil E., van Belkum A., Hays J.P. Principles and technical aspects of PCR Amplification. NY, Springer, 2008.
6. Maniatis T., Fritsch E. E., Sambrook J. Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborotory, New York, 2003.
7. SantaLucia J. Physical Principles and Visual-OMP Software for Optimal PCR Design. In: Methods in Molecular Biology: PCR Primer Design. A. Yuryev (Ed.). Humana Press,
Totowa, New Jersey, 2007; 3–34.
8. Yangjian Cheng, Jianjun Niu, Yongyou Zhang, Jianwei Huang. Preparation of His-Tagged Armored RNA Phage Particles as a Control of Serve Acute Respiratory Syndrome Coronavirus.
J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (10): 3557–3562.
9. Yuxiang Wei, Changmei Yang, Baojun Wei et al. RNase-Resistant Virus-Like Particles Containing Long Chimeric RNA Sequences Produced by Two-Plasmid Coexpression System. J. Clin. Microbiol. 2008; 46 (5): 1734–1740.
10. Libikova H., Mayer V., Kozuch O. Изучение цитопатогенных агентов, выделенных из клещей Ixodes persulcatus. Acta Virol., 1964; 8(4), 289–301.
11. Карпович Л.Г., Сергеева Г.И. Опыт применения тканевых культур для выделения и идентификации вируса клещевого энцефалита и нового кемеровского вируса. В кн.: Материалы XVII науч. сессии Института вирусологии. Ч. 2. М., 1964: 46–48.

Об авторах / Для корреспонденции

Дедков Владимир Георгиевич, мл. науч. сотр. ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
Адрес: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а
E-mail: vgdedkov@mail.ru

Маркелов Михаил Леонидович, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. ФГБУ НИИ медицины труда РАМН
Войцеховская Яна Александровна, канд. биол. наук, науч. сотр. ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора
Карганова Галина Григорьевна, д-р биол. наук, доц., зав. лаб. биологии арбовирусов ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН
Гмыль Анатолий Петрович, канд. биол. наук, доц., зав. лаб. биохимии, ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН
Пиванова Галина Петровна, канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. биологии арбовирусов ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова
Козловская Любовь Игоревна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. биохимии ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН
Шипулин Герман Александрович, канд. мед. наук, руководитель отд. молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора

Ключевые слова

Orbiviridaeвирус Кемерово

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь