Решающая роль макрофагов в формировании аневризм внутричерепных сосудов

Предпосылки и цель исследования. Причиной аномального ремоделирования сосудов являются гемодинамические нагрузки, а ключевым процессом в патофизиологии аневризм внутричерепных сосудов считают воспаление. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют об инфильтрации стенки аневризм внутричерепных сосудов человека воспалительными клетками, преимущественно макрофагами. Используя модель внутричерепных аневризм у мышей, мы проверили, играют ли макрофаги решающую роль в формировании аневризм внутричерепных сосудов. Методы. У взрослых самцов мышей индуцировали развитие аневризм внутричерепных сосудов с помощью комбинации однократного введения в спинномозговую жидкость эластазы и артериальной гипертензии, индуцированной ангиотензинном II. Сформированные аневризмы оценивали через 3 недели. Роль макрофагов изучали с помощью фармакологического уменьшения их числа на фоне применения липосом с клодронатом. Кроме того, оценивали частоту развития аневризм у мышей с отсутст- вием белка хемотаксиса моноцитов-1 (CCL2) и у мышей с отсутствием матриксной металлопротеиназы-12 (макрофагальной эластазы). Результаты. При изучении аневризм внутричерепных сосудов на модели выявили наличие лейкоцитарной инфильтрации в стенках аневризм, преимущественно за счет макрофагов. У мышей, которым провели фармакологическое уменьшение числа макрофагов, частота развития аневризм была значительно ниже, чем у мышей контрольной группы (1 из 10 против 6 из 10; р<0,05). Кроме того, у мышей с отсутствием белка хемотаксиса моноцитов-1 частота развития аневризм также была ниже по сравнению с частотой развития аневризм у мышей дикого типа (2 из 10 vs 14 из 20, р<0,05). Между группами мышей с отсутствием матриксной металлопротеиназы-12 и мышами дикого типа разницы в частоте развития аневризм не было. Заключение. Полученные данные свидетельствуют о решающей роли макрофагов и свойственных макрофагам функций в формировании аневризм внутричерепных сосудов на модели.

В обсервационных и генетических исследованиях было высказано предположение о потенциальной роли воспаления в формировании аневризм внутричерепных сосудов – как разорвавшихся, так и неразорвавшихся [1–6]. Макрофагальная инфильтрация в разорвавшихся и неразорвавшихся аневризмах у людей была убедительно подтверждена документальными доказательствами [2, 3, 7]. Выраженность воспаления в аневризмах, по всей вероятности, связана с разрушением и разрывом стенки аневризмы [3, 7].

Недавно нам удалось продемонстрировать решающую роль макрофагов и выделяемых ими цитокинов в гемодинамически-индуцированном ремоделировании сосудистой стенки [8, 9]. По всей видимости, ремоделирование сосудов в сочетании с воспалением играет ключевую роль в патофизиологии аневризм внутричерепных сосудов [4, 10]. Непрерывное ремоделирование сосудов может привести к росту аневризмы и ее разрыву [1, 11]. Путем опосредованного участия в воспалении и гемодинамическииндуцированном ремоделировании сосудов макрофаги могут играть важнейшую роль в развитии, росте и разрыве внутричерепных аневризм.

В данной работе мы изучали предполагаемое решающее значение макрофагов в формировании аневризм внутричерепных сосудов с помощью экспериментальной модели на мышах, в которой воспроизвели основные особенности аневризм внутричерепных сосудов у людей. Во-первых, мы оценили влияние фармакологического снижения числа макрофагов с помощью липосом с клодронатом на формирование аневризм. Во-вторых, оценили формирование аневризм у мышей с отсутствием белка хемотаксиса моноцитов-1 (МСР-1, CCL2). MCP-1 является фактором хемотаксиса, имеющим решающее значение для нормального осуществления свойственных макрофагам функций. У мышей с нокаутом гена MCP-1 было снижено число макрофагов/моноцитов и нарушена функция макрофагов. Таким образом, эту группу мышей использовали в качестве генетического эквивалента группе мышей, у которых провели фармакологическое снижение числа макрофагов и моноцитов, в различных физиологических и патологических условиях [12, 13].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили в соответствии со стандартами, утвержденными комитетом Institutional Animal Care and Use Committee Университета Калифорнии, Сан-Франциско.

В экспериментальной модели использовали 8- и 9-недельных мышей с артериальной гипертензией, у которых индуцировали развитие аневризм внутричерепных сосудов, как было описано ранее [11]. В этой модели для индуцирования формирования аневризм внутричерепных сосудов у мышей объединили два хорошо известных клинических фактора, связанных с развитием внутричерепных аневризм у людей – артериальную гипертензию и разрушение эластичной пластинки. Мы выполнили однократную стереотаксическую инъекцию эластазы в спинномозговую жидкость в правую базальную цистерну. Раствор эластазы (17 mU) объемом 2,5 мкл вводили со скоростью 0,2 мкл/мин (Ultramicropump, World Precision Instruments). Артериальную гипертензию индуцировали путем длительной подкожной инфузии ангиотензина II в дозе 1000 нг/кг/мин в течение 3 недель через имплантированный осмотический насос (Alzet pump; Durect) [11, 14].

Систолическое артериальное давление у мышей измеряли до лечения, через 1 неделю после инъекции эластазы и через 2 недели после инъекции эластазы путем непрямого измерения с помощью хвостовой манжеты. Через 3 недели мы подвергли мышей эвтаназии и провели перфузию животных красителем бромфенолом синим. Два ослепленных наблюдателя оценили формирование аневризм внутричерепных сосудов путем изучения Виллизиева круга и его основных ветвей под препаровальной лупой (х10). Критерием наличия аневризмы внутричерепных сосудов считали локальное выпячивание наружу стенки сосуда Виллизиева круга или основных крупных ветвей, как было описано ранее [10, 11]. После изучения сосудов Виллизиева круга все образцы тканей мозга подвергли заморозке для последующего иммуногисто-химического окрашивания.

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СНИЖЕНИЕ ЧИСЛА МАКРОФАГОВ

Снижения числа макрофагов достигли с помощью внутривенного введения инкапсулированного в липосомы дихлорметилен дифосфоната (липосомы с клодронатом) [15]. Мы использовали 8- и 9-недельных самцов мышей линии C57BL/6J (n=10 в каждой группе). Клодронат был предоставлен компанией Roche Diagnostics GmbH (Мангейм, Германия). Липосомы с клодронатом вводили животным внутривенно за 2 суток до инфузии эластазы и ангиотензина II. При таком режиме введения происходит снижение числа макрофагов менее чем до 10% от их исходного числа [9, 16]. Животным контрольной группы вводили аналогичный объем липосом, содержащих фосфатно-солевой буфер (липосомы с ФСБ). Мы оценили эффективность снижения числа макрофагов путем иммуногистохимического анализа макрофагов в селезенке, как было описано ранее [9, 16].

ЧАСТОТА РАЗВИТИЯ АНЕВРИЗМ У МЫШЕЙ С НОКАУТОМ ГЕНА МСР-1 И У МЫШЕЙ С НОКАУТОМ ГЕНА МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-12

Оценили частоту развития аневризм у мышей с нокаутом гена MCP-1 и мышей с нокаутом гена матриксной металлопротеиназы-12 (ММР-12) ...

И. Канематсу, М. Канематсу, К. Куриара, И. Тада, Т.-Л. Тзоу, Н. ван Рооиджен, М.Т. Лавтон, В.Л. Йанг, Е.И. Лианг, И. Нуки, Т. Хашимото