STROKE №2 (30) / 2013
Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток уменьшает повреждение головного мозга после неонаталь- ного инсульта
Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht, the Netherlands; Departments of Neurology and Pediatrics, University of California San Francisco, San Francisco, CA; Department of Symptom Research, University of Texas, MD Anderson Cancer Centre, Houston, TX.
Предпосылки и цель исследования. Повреждение головного мозга, вызванное инсультом, является частой причиной перинатальной заболеваемости и смертности с ограниченными терапевтическими возможностями. Было показано, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) приводит к улучшению исхода после неонатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга в основном за счет секреции факторов роста, стимулирующих процессы репарации. Изучили влияние лечения с помощью МСК на улучшение восстановления после неонатального инсульта, а также влияние лечения МСК с гиперэкспрессией нейротрофического фактора головного мозга (МСК-НФГМ) на дальнейшее улучшение восстановления. Методы. Выполнили временную окклюзию средней мозговой артерии длительностью 1,5 часа у 10-дневных крыс. Через три дня после реперфузии крысятам с признаками повреждения головного мозга, по результатам диффузно-взвешенной МРТ (ДВ-МРТ), интраназально вводили МСК, МСК-НФГМ или плацебо. Для определения эффекта лечения МСК проанализировали очаг повреждения головного мозга, сенсомоторную функцию и пролиферацию клеток головного мозга. Результаты. При интраназальном введении МСК и МСК-НФГМ произошло значительное уменьшение размера очага инфаркта и потери серого вещества по сравнению с таковыми у крыс, получавших плацебо, без значимых различий между группами, получавшими МСК и МСК-НФГМ. При лечении МСК-НФГМ значительно снизилась утрата белого вещества головного мозга без значимых различий между группами, получавшими МСК и МСК-НФГМ. Также отметили улучшение двигательной функции на фоне введения МСК по сравнению с крысами, получавшими плацебо. Лечение МСК-НФГМ привело к дополнительному значительному восстановлению двигательных функций через 14 дней после окклюзии средней мозговой артерии, но через 28 дней после окклюзии средней мозговой артерии значимых различий между группами МСК и МСК-НФГМ не было. Кроме того, лечение МСК или МСК-НФГМ индуцировало длительно сохраняющуюся пролиферацию клеток в ишемизированном полушарии. Выводы. Интраназальное введение МСК после неонатального инсульта является перспективным методом лечения этой патологии. В этой экспериментальной парадигме, трансплантация МСК и МСК с гиперэкспрессией НФГМ одинаково эффективны в отношении уменьшения очага ишемического повреждения головного мозга.
Неонатальный инсульт развивается приблизительно у 1 из 4000 живорожденных и ассоциирован с высоким уровнем смертности [1]. У новорожденных с перинатальным инсультом часто развивается инвалидность с моторным дефицитом, когнитивными нарушениями и эпилепсией [2]. В настоящее время не существует общепринятых методов лечения для этой уязвимой группы новорожденных. Таким образом, развитие новых стратегий лечения является насущной потребностью.
В течение последних десятилетий в нескольких исследованиях оценивали эффективность потенциальных методов профилактики прогрессирования повреждения головного мозга посредством фармакологической нейропротекции. В последнее время изучали препараты для улучшения восстановления поврежденного незрелого головного мозга. В нескольких исследованиях с использованием различных типов повреждения головного мозга, в т.ч. на модели инсульта у взрослых с окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) и модели неонатального гипоксически-ишемического (ГИ) повреждения головного мозга показали, что введение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способствует функциональному неврологическому восстановлению [3, 4]. Положительный эффект от трансплантации МСК может быть связан с замещением поврежденных клеток трансплантированными. Тем не менее данные литературы позволяют предположить, что, скорее всего, трансплантированные МСК способствуют восстановлению посредством стимуляции секреции факторов роста и факторов дифференцировки, тем самым обеспечивая условия, в которых происходит стимуляция процессов репарации, таких как нейро- и ангиогенез [5]. В ранее проведенных нами исследованиях и в других работах было показано, что в ответ на секрецию факторов роста в поврежденном головном мозге МСК выделяют несколько факторов, которые могут стимулировать процессы репарации в головном мозге [5-7].
В настоящем исследовании изучали влияние трансплантации МСК на улучшение функционального исхода и уменьшение объема очага поражения в модели неонатального инсульта у крыс. Кроме того, выясняли возможность повышения терапевтического потенциала трансплантации МСК за счет генетической модификации МСК с гиперэкспрессией нейротрофического фактора головного мозга (НФГМ).
МЕТОДЫ
Аденовирусный вектор
Сконструировали аденовирусный вектор (PAD- HM41-K7; Alphagen, Иокогама, Япония), несущий ген для полилизин-мутированного фиберкнота, как было описано ранее [8]. Мышиную кДНК НФГМ клонировали в полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с общей РНК, выделенной из головного мозга в качестве матрицы. Наличие последовательностей НФГМ подтверждали путем секвенирования и сравнения с последовательностью GenBank NM_007540. Использовали следующие последовательности мышиного праймера НФГМ: вперед 5’-TCT AGACACCCCACCATGACCATCCTTTTCCTT-3’, назад 5’-TCTТСССCTТТТAATGGTCAGT-3’. кДНК НФГМ объединили с внутренним сайтом связывания рибосомы, усиленным последовательностью зеленого флуоресцентного белка (IRES-е-GFP) для мечения инфицированных клеток. Последовательность НФГМ- IRES-еGFP встраивали в вектор pShuttle2 между сайтами XbaI и AflII, в результате чего получались pShuttle2-НФГМ-IE плазмиды. pАd-HM41- K7-НФГМ-IE был сконструирован путем лигирования I-CeuI/PI-SceI-расщепленного pShuttle2-НФГМ-IE с I-CeuI/PI-SceI-расщепленного pАd-HM41-K7. Сконструировали пустой контрольный вектор, состоящий только из вставки последовательности IRES-еGFP (pАd-HM410K7-IE).
Вирусные частицы были получены путем трансфекции PacI-расщепленного pАd-HM41-K7-НФГМ-IE в 293 клетки с Липофектамином2000 (Invitrogen). Перед использованием определяли титр вируса, штаммы исследовали на предмет возможной контаминации компентентными к репликации вирусами.
Мезенхимальные стволовые клетки
МСК крыс линии Sprague-Dawley (GIBCO) культивировали, согласно инструкциями производителя. Клетки были отрицательными по миелоидным и гемопоэтическим клон-специфическим антигенам и положительными по CD29, CD44, CD90 и CD106. МСК высевали плотностью 3х106 клеток на 25 см2 колбы, подвергали воздействию вирусных частиц pАd- НМ41-К7-НФГМ-Ш или pАd-HM41-K7-IE в 7,5 мл среды Игла, модифицированной Дульбекко в течение 6 часов, после чего культуры промывали 3 раза средой Игла, модифицированной Дульбекко, и повторно культивировали в нормальной среде. После заражения МСК культивировали в течение дополнительных 24 часов, после чего выполняли трансплантацию.
Животные
Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Калифорнийского университета, Сан-Франциско, и проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (Министерство здравоохранения и социальных служб США, номер публикации 85-23, 1985 г.).
Транзиторную окклюзию правой средней мозговой артерии на протяжении 1,5 часов проводили у 10-дневных крыс линии Sprague-Dawley, как описывали ранее [9]...