STROKE №2 (30) / 2013

Трансплантация мезенхимальных стволовых клеток уменьшает повреждение головного мозга после неонаталь- ного инсульта

1 мая 2013

Laboratory of Neuroimmunology and Developmental Origins of Disease, University Medical Center Utrecht, Utrecht, the Netherlands; Departments of Neurology and Pediatrics, University of California San Francisco, San Francisco, CA; Department of Symptom Research, University of Texas, MD Anderson Cancer Centre, Houston, TX.

Предпосылки и цель исследования. Повреждение головного мозга, вызванное инсультом, является частой причиной перинатальной заболеваемости и смертности с ограниченными терапевтическими возможностями. Было показано, что трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (МСК) приводит к улучшению исхода после неонатального гипоксически-ишемического повреждения головного мозга в основном за счет секреции факторов роста, стимулирующих процессы репарации. Изучили влияние лечения с помощью МСК на улучшение восстановления после неонатального инсульта, а также влияние лечения МСК с гиперэкспрессией нейротрофического фактора головного мозга (МСК-НФГМ) на дальнейшее улучшение восстановления. Методы. Выполнили временную окклюзию средней мозговой артерии длительностью 1,5 часа у 10-дневных крыс. Через три дня после реперфузии крысятам с признаками повреждения головного мозга, по результатам диффузно-взвешенной МРТ (ДВ-МРТ), интраназально вводили МСК, МСК-НФГМ или плацебо. Для определения эффекта лечения МСК проанализировали очаг повреждения головного мозга, сенсомоторную функцию и пролиферацию клеток головного мозга. Результаты. При интраназальном введении МСК и МСК-НФГМ произошло значительное уменьшение размера очага инфаркта и потери серого вещества по сравнению с таковыми у крыс, получавших плацебо, без значимых различий между группами, получавшими МСК и МСК-НФГМ. При лечении МСК-НФГМ значительно снизилась утрата белого вещества головного мозга без значимых различий между группами, получавшими МСК и МСК-НФГМ. Также отметили улучшение двигательной функции на фоне введения МСК по сравнению с крысами, получавшими плацебо. Лечение МСК-НФГМ привело к дополнительному значительному восстановлению двигательных функций через 14 дней после окклюзии средней мозговой артерии, но через 28 дней после окклюзии средней мозговой артерии значимых различий между группами МСК и МСК-НФГМ не было. Кроме того, лечение МСК или МСК-НФГМ индуцировало длительно сохраняющуюся пролиферацию клеток в ишемизированном полушарии. Выводы. Интраназальное введение МСК после неонатального инсульта является перспективным методом лечения этой патологии. В этой экспериментальной парадигме, трансплантация МСК и МСК с гиперэкспрессией НФГМ одинаково эффективны в отношении уменьшения очага ишемического повреждения головного мозга.

Неонатальный инсульт развивается приблизительно у 1 из 4000 живорожденных и ассоциирован с высоким уровнем смертности [1]. У новорожденных с перина­тальным инсультом часто развивается инвалидность с моторным дефицитом, когнитивными нарушениями и эпилепсией [2]. В настоящее время не существует общепринятых методов лечения для этой уязвимой группы новорожденных. Таким образом, развитие новых стратегий лечения является насущной потреб­ностью.

В течение последних десятилетий в нескольких исследованиях оценивали эффективность потенци­альных методов профилактики прогрессирования повреждения головного мозга посредством фарма­кологической нейропротекции. В последнее время изучали препараты для улучшения восстановле­ния поврежденного незрелого головного мозга. В нескольких исследованиях с использованием раз­личных типов повреждения головного мозга, в т.ч. на модели инсульта у взрослых с окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) и модели неонатально­го гипоксически-ишемического (ГИ) повреждения головного мозга показали, что введение мезенхималь­ных стволовых клеток (МСК) способствует функ­циональному неврологическому восстановлению [3, 4]. Положительный эффект от трансплантации МСК может быть связан с замещением поврежденных кле­ток трансплантированными. Тем не менее данные литературы позволяют предположить, что, скорее всего, трансплантированные МСК способствуют восстановлению посредством стимуляции секреции факторов роста и факторов дифференцировки, тем самым обеспечивая условия, в которых происходит стимуляция процессов репарации, таких как нейро- и ангиогенез [5]. В ранее проведенных нами исследова­ниях и в других работах было показано, что в ответ на секрецию факторов роста в поврежденном головном мозге МСК выделяют несколько факторов, которые могут стимулировать процессы репарации в головном мозге [5-7].

В настоящем исследовании изучали влияние транс­плантации МСК на улучшение функционально­го исхода и уменьшение объема очага поражения в модели неонатального инсульта у крыс. Кроме того, выясняли возможность повышения терапевтического потенциала трансплантации МСК за счет генетичес­кой модификации МСК с гиперэкспрессией нейротрофического фактора головного мозга (НФГМ).

МЕТОДЫ

Аденовирусный вектор

Сконструировали аденовирусный вектор (PAD- HM41-K7; Alphagen, Иокогама, Япония), несущий ген для полилизин-мутированного фиберкнота, как было описано ранее [8]. Мышиную кДНК НФГМ клонировали в полимеразной цепной реакции в режи­ме реального времени с общей РНК, выделенной из головного мозга в качестве матрицы. Наличие после­довательностей НФГМ подтверждали путем секвенирования и сравнения с последовательностью GenBank NM_007540. Использовали следующие последователь­ности мышиного праймера НФГМ: вперед 5’-TCT AGACACCCCACCATGACCATCCTTTTCCTT-3’, назад 5’-TCTТСССCTТТТAATGGTCAGT-3’. кДНК НФГМ объединили с внутренним сайтом связывания рибосомы, усиленным последовательностью зеленого флуоресцентного белка (IRES-е-GFP) для мечения инфицированных клеток. Последовательность НФГМ- IRES-еGFP встраивали в вектор pShuttle2 между сайта­ми XbaI и AflII, в результате чего получались pShuttle2-НФГМ-IE плазмиды. pАd-HM41- K7-НФГМ-IE был сконструирован путем лигирования I-CeuI/PI-SceI-расщепленного pShuttle2-НФГМ-IE с I-CeuI/PI-SceI-расщепленного pАd-HM41-K7. Сконструировали пус­той контрольный вектор, состоящий только из вставки последовательности IRES-еGFP (pАd-HM410K7-IE).

Вирусные частицы были получены путем транс­фекции PacI-расщепленного pАd-HM41-K7-НФГМ-IE в 293 клетки с Липофектамином2000 (Invitrogen). Перед использованием определяли титр вируса, штам­мы исследовали на предмет возможной контаминации компентентными к репликации вирусами.

Мезенхимальные стволовые клетки

МСК крыс линии Sprague-Dawley (GIBCO) куль­тивировали, согласно инструкциями производите­ля. Клетки были отрицательными по миелоидным и гемопоэтическим клон-специфическим антигенам и положительными по CD29, CD44, CD90 и CD106. МСК высевали плотностью 3х106 клеток на 25 см2 колбы, подвергали воздействию вирусных частиц pАd- НМ41-К7-НФГМ-Ш или pАd-HM41-K7-IE в 7,5 мл среды Игла, модифицированной Дульбекко в течение 6 часов, после чего культуры промывали 3 раза сре­дой Игла, модифицированной Дульбекко, и повторно культивировали в нормальной среде. После зараже­ния МСК культивировали в течение дополнительных 24 часов, после чего выполняли трансплантацию.

Животные

Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Калифорнийского универ­ситета, Сан-Франциско, и проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабора­торных животных (Министерство здравоохранения и социальных служб США, номер публикации 85-23, 1985 г.).

Транзиторную окклюзию правой средней мозговой артерии на протяжении 1,5 часов проводили у 10-днев­ных крыс линии Sprague-Dawley, как описывали ранее [9]...

К.Т.Дж. ван Велховен, Р.А. Шелдон, А. Кавелаарс, Н. Деругин, З.С. Векслер, Г.Л.Д.М. Виллемен, М. Маас, К.Дж. Хеиджнен, Д.М. Ферриеро
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.