Кардиология №2 / 2012
Участие NO-зависимых механизмов действия апелина в защите миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения
ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздравсоцразвития России, 121552 Москва, 3-я Черепковская ул. 15а
Апелин-12 (А-12) получен методом автоматического твердофазного синтеза пептидов; его гомогенность и структура подтверждены с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения, 1Н-ядерно-магнитно-резонансной-спектроскопии и масс-спектрометрии. Острый инфаркт миокарда (ИМ) у наркотизированных крыс линии Вистар моделировали с помощью 40-минутной окклюзии передней нисходящей коронарной артерии (ПНА) с последующей 60-минутной реперфузией. А-12 вводили одновременно с началом реперфузии в дозе 0,07, 0,35 или 0,70 мкмоль/кг массы тела; ингибитор NO-синтазы метиловый эфир NG-нитро-L-аргинина (L-NAME) —
в дозе 10 мг/кг массы тела за 10 мин до окончания региональной ишемии отдельно или перед последующим введением А-12 в дозе 0,35 мкмоль/кг; в контроле — изотонический раствор натрия хлорида. Введение указанных доз А-12 сопровождалось снижением систолического артериального давления (САД) до 85, 58 и 56% от исходного уровня соответственно и практически полным восстановлением его к концу реперфузии, а также достоверным ограничением размера ИМ соответственно на 26, 40 и 33% по сравнению с контролем. Под влиянием дозы А-12 0,35 мкмоль/кг активность фракции МВ креатинкиназы (МВ-КК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в плазме в конце реперфузии снижалась соответственно на 56 и 47% по сравнению с контролем. Введение L-NAME вызывало увеличение САД, которое сохранялось до конца реперфузии, но не влияло на размер ИМ по сравнению с контролем. При введении А-12 на фоне ингибирования NO-синтазы с помощью L-NAME САД снижалось в достоверно меньшей степени, чем при использовании только пептида. В этом случае ИМ был на 26% больше, а активность МВ-КК и ЛДГ в конце реперфузии была в 1,8 и 1,5 раза выше, чем при использовании только А-12. Результаты указывают на то, что NO является одним из ключевых медиаторов защитного действия апелина.
Разработка подходов к снижению повреждения сердца, вызванного ишемическим и реперфузионным стрессом, является актуальной задачей экспериментальной кардиологии. В последние годы внимание многих исследователей привлекает изучение адипоцитокина апелина и его рецептора APJ, участвующих в регуляции тонуса коронарных сосудов и сократимости миокарда [1, 2]. Обнаружено, что экзогенные С-концевые фрагменты апелина (апелин-36, -13 и -12) способны ограничивать размер инфаркта миокарда (ИМ) и улучшать восстановление функции сердца у экспериментальных животных после периода тотальной или региональной ишемии [3—7]. В кардиомиоцитах крыс при моделировании оксигенационного стресса и в условиях энергетического дефицита апелин-13 блокировал открытие митохондриальной поры и апоптоз [3, 5, 8]. Предполагают, что сокращение гибели кардиомиоцитов при реперфузии
под действием апелина связано с активацией каскадов, включающих PI3-Akt-киназы и МАР-киназы, мишенями которых являются эндотелиальная NO-синтаза (eNOS), рибосомальная p70S6-киназа и проапоптозный белок BAX/BAD [3, 5, 9,10]. Эта гипотеза была подтверждена отменой защитного действия апелина-13 в присутствии специфических ингибиторов компонентов киназных каскадов PI3-Akt и ERK1/2 [3, 5, 8].
Участие NOS в механизмах гипотензивного действия С-концевых фрагментов апелина продемонстрировано ранее в экспериментальных и клинических исследованиях. У наркотизированных крыс гипотензивный эффект апелина-12 (в большей степени, чем апелина-36 и -13) сопровождался увеличением содержания в плазме нитритов и нитратов и отменялся в присутствии ингибитора NOS метилового эфира NG-нитро-L-аргинина (L-NAME) [11]. Сходный дозозависимый характер снижения среднего артериального давления (АД) при инфузии А-12 был подтвержден на бодрствующих крысах [12]. Снижение дисфункции эндотелия аорты у диабетических мышей под действием апелина-13 происходило одновременно с активацией сигнального пути PI3K-Akt-eNOS и сопровождалось фосфорилированием Akt по остаткам Сер-473 и фосфорилированием eNOS по остаткам Сер1177 [13]. При этом вазодилатационный эффект апелина отменялся в присутствии L-NAME и ингибитора PI3
киназы LY2940002, что подтверждает значение фосфорилирования eNOS, инициируемого апелином, при сахарном диабете. На модели атеросклероза у knock-out мышей без гена аполипопротеина Е [Pyr1]апелин-13 уменьшал образование аневризмы аорты и снижал повреждающее действие ангиотензина II благодаря уменьшению генерации активных форм кислорода [14]. Ключевая роль NOS
в действии пептида была подтверждена методом ЭПР с помощью спиновой ловушки NO и отменой защитного действия пептида в присутствии L-NAME. Внутривенное введение [Pyr1]апелина-13 и апелина-36 здоровым добровольцам и пациентам с хронической сердечной недостаточностью вызывало NO-зависимое расширение артерий, которое отменялось введением ингибитора NOS
NG-монометил-L-аргинина (NG-MMLA) [15, 16].
Значение сигнального каскада PI3K-Akt-eNOS и образования NO в кардиопротекторных эффектах
апелина не столь очевидно. Так, снижение ишемического и реперфузионного повреждения, моделированного в изолированном перфузируемом сердце крысы и культуре неонатальных кардиомиоцитов, под действием апелина-13 сопровождалось одновременным увеличением экспрессии еNOS и фосфорилирования Akt и ERK1/2 [5]. Об участии NO в механизмах защитного действия апелина свидетельствует отмена уменьшения размеров ИМ в изолированном перфузируемом сердце крысы при одновременном введении апелина-13 и ингибитора NOS NG-нитро-L-аргинина (L-NNA) [17]. В то же время несмотря на активацию PI3-Akt-и ERK1/2-киназ под действием апелина-13 в изолированном сердце мыши, подвергнутом региональной ишемии и реперфузии, увеличения фосфорилирования
еNOS обнаружено не было [3]. Помимо ингибирования открытия митохондриальной поры и апоптоза уменьшение реперфузионного повреждения миокарда под действием апелина, вызванное экспрессией eNOS, может быть связано с антиоксидантными свойствами NO. На такую возможность указывают снижение генерации активных форм кислорода и уменьшение содержания в сердце и кардиомиоцитах крысы малонового диальдегида под действием апелина-13 [5, 18]. К настоящему времени практически не изучено значение NOS в механизмах защитного действия апелина при реперфузионном повреждении сердца in vivo.
Данная работа предпринята с целью восполнить этот пробел с использованием модели острого ИМ у наркотизированных крыс. Для этого изучены дозозависимое действие экзогенного апелина-12 и влияние ингибирования активности NOS на необратимые повреждения миокарда при реперфузии. Критериями повреждения служили размер ИМ и активности маркеров некроза в крови; для ингибирования изоформ NOS использовали L-NAME.
Материал и методы
Получение апелина-12. А-12 (H-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-OH, M=1442,7) получен путем автоматического твердофазного синтеза на пептидном синтезаторе фирмы Applied Biosystems 431A (Германия) с использованием Fmoc-мето...
