Акушерство и Гинекология №9-1 (приложение) / 2024
ВЫДЕЛЕНИЕ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК СПЕРМАТОГЕННОГО ЭПИТЕЛИЯ
Научно-исследовательский институт имени академика А.П. Авцына государственного научного центра Российской Федерации ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» (Министерство науки и высшего образования РФ), Москва, Россия
Актуальность исследования. Получение клеток сперматогенного эпителия разных стадий дифференцировки необходимо для изучения биохимических и молекулярно-биологических процессов сперматогенеза. Разделение сперматогенных клеток проводят для изучения стадий и механизмов их дифференцировки. Метод выделения с применением проназы Е по T.G. Pretlow показывает лучшие результаты по уровню жизнеспособности выделенных клеток и низкому количеству образующихся симпластов, однако не исключает доработок и внесения изменений в протокол.
Цель исследования: выделение клеток сперматогенного эпителия оптимальным методом с последующим их фракционированием.
Материалы и методы исследования. В работе использовали самцов мышей линии С57BL/6 массой тела 25-30 г. Выполняли забор семенников, делали надрез белочной оболочки семенника и извлекали извитые семенные канальцы одним блоком.
Семенные канальцы помещали в раствор DMEM с 25 mM HEPES и 4,5 г/л глюкозы, 0,16 мг/мл коллагеназы тип 4,5% фетальной сыворотки – FCS и инкубировали 20 мин при 37°С в СО2 инкубаторе. После инкубации с раствором коллагеназы семенные канальцы единым блоком переносили в раствор DPBS, без Ca2+, Mg2+, 0,5% FCS и пипетировали. После оседания семенных канальцев супернатант, содержащий интерстициальные клетки и клетки канальцев, удаляли. Процедуру повторяли 2-3 раза.
Далее семенные канальцы переносили в инкубационную среду: DMEM с 25 mM HEPES, 4,5 г/л глюкозы, 0,05% проназы Е, 20µг ДНКазы и инкубировали в течение 10 мин ...
