Возрастное ухудшение исходов после инсульта с поражением белого вещества головного мозга. Роль оксидантного повреждения и медиаторов воспаления

Предпосылки и цель исследования. На долю инсульта с поражением субкортикального белого вещества (ИБВГМ) приходится до 30% всех вариантов инсульта. Механизмы повреждения и восстановления олигодендроцитов и аксонов играют центральную роль в развитии поражения и восстановлении при этих вариантах инсульта, и для всестороннего изучения этих механизмов необходима специализиро- ванная экспериментальная модель, отличающаяся от общепринятых моделей инсульта с поражением серого вещества при окклюзии крупной артерии. Недостаточное восстановление после инсульта у больных пожилого возраста указывает на наличие возможного возрас- тного влияния на процессы повреждения и восстановления, но такое влияние при ИБВГМ ранее не изучали. Методы. Развитие ИБВГМ индуцировали с помощью очаговых микроинъекций вазоконстриктора N5-(1-иминоэтил)-L-орнитина в субкортикальное белое вещество вентральнее зоны моторной коры верхних конечностей молодым (2 месяца) мышам, животным среднего (15 месяцев) возраста и старым (24 месяца) мышам. Результаты. Индукция ИБВГМ приводила к локальной гибели олигодендроцитов с бóльшим числом апоптотических клеток и бóльшему окислительному повреждению в головном мозге у старых мышей, чем у мышей молодого возраста. Повышение экс- прессии хемотаксического протеина-1 и фактора некроза опухоли α (ФНО-α) в нейронах моторной коры коррелировало с бóльшим объ- емом активации микроглии в головном мозге старых мышей через 7 дней после ИБВГМ. Через 2 месяца у старых мышей наблюдали более выраженную атрофию белого вещества головного мозга и значительную потерю кортикостриальных связей по сравнению с молодыми мышами. При проведении поведенческого тестирования выявили ухудшение моторного дефицита передних конечностей после инсульта, коррелирующее с возрастом и ухудшением функционального восстановления у старых животных в отдаленном периоде. Выводы. Возраст оказывает огромное влияние на исход после ИБВГМ, что обусловлено пролонгированной гибелью клеток и выраженным окислительным повреждением, усилением воспаления, более выраженной вторичной атрофией белого вещества и неблагоприятным поведенческим эффектом, которые наблюдали у старых животных по сравнению с молодыми животными.

На долю инсульта с поражением субкортикального белого вещества (ИБВГМ) приходится до 30% всех подтипов инсульта [1, 2] с разрушительными клиническими последствиями. Эти инфаркты приводят к развитию очагового дефицита с неполным восстановлением и являются второй по значимости причиной деменции [3, 4]. Несмотря на обилие литературы, описывающей доклинические исследования, и использованием моделей инсульта с поражением серого вещества при окклюзии крупной артерии у животных, в настоящее время проведено лишь несколько исследований, посвященных изучению механизмов репарации и восстановления белого вещества, что может быть обусловлено отсутствием эффективных моделей ИБВГМ у животных.

Кроме того, большинство исследований с использованием модели ишемического инсульта были выполнены на молодых животных. Ишемический инсульт развивается в основном у людей старшего возраста, и восстановление у пожилых пациентов происходит хуже, чем у пациентов молодого возраста [5, 6].

Существуют различия в нейрофизиологии между молодыми и старыми животными, а патофизиологические особенности ишемии головного мозга изменяются на протяжении всей жизни [7, 8]. Кроме того, эффективность ремиелинизации при поражении белого вещества с возрастом уменьшается [9]. Таким образом, в исследованиях с использованием молодых животных для моделирования ишемического инсульта невозможно полностью оценить влияние ишемии на ткань головного мозга в пожилом возрасте. Недавно мы разработали модель субкортикального инсульта с поражением белого вещества в моторной зоне верхних конечностей у мышей, в которой смоделировали многие особенности этого заболевания у людей. В этой модели индуцированная очаговая ишемия приводит к гибели клеток и разрушению белого вещества в ядре инфаркта и частичному разрушению миелина, гибели аксонов и олигодендроцитов в периинфарктной зоне [10, 11]. В настоящем исследовании эту модель использовали для изучения различий в особенностях повреждения и функциональных исходах после ишемии белого вещества головного мозга между молодыми и старыми животными.

МЕТОДЫ

Мыши

Все эксперименты проводили в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по защите животных, их проведение было одобрено Комитетом по исследованиям на животных Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.

В данном исследовании использовали 32 мыши линии C57/BL6 в возрасте 3 месяцев (Jackson), 24 мыши линии C57/BL в возрасте 15 месяцев и 28 мышей линии C57/BL в возрасте 24 месяцев (National Institute on Aging). Группы животных (n=6–8 на группу) наблюдали в 1-й, 2, 7 и 56-й дни после инсульта или псевдовмешательства.

Инсульт с поражением белого вещества

Развитие инсульта с поражением белого вещества индуцировали способом, описанным ранее [10], с некоторыми модификациями. Вазоконстриктор N5-(1-иминоэтил)-L-орнитин (27 мг/мл в стерильном физиологическом растворе; Millipore) вводили через микропипетки в кору под углом 45° с помощью задне-нижнего и передне-верхнего доступов в белое вещество моторной зоны верхних конечностей. Эта процедура обеспечивает выраженное сужение сосудов в месте инъекции, что приводит к развитию очага инфаркта [10, 12]. Выполнили три инъекции (каждая по 200 нл раствора N5-(1-иминоэтил)-L-орнитина) в следующих координатах: A/P: +0,5, 0, -0,5; M/L: -0,96 (для всех 3 инъекций); и D/V: -1,2, -1,15, -1,1. Пипетку оставляли в месте инъекции в течение 5 минут после вмешательства для обеспечения надлежащей диффузии. Животным контрольной группы выполняли псевдовмешательство, в ходе которого проводили краниотомию, как и животным опытной группы, но без последующих инъекций.

Обработка ткани, микроскопия и стереотаксис

Методы обработки вещества головного мозга были описаны ранее [10, 11] (см. подробные методы окрашивания в дополнительных данных on-line). Получали изображения высокого разрешения и конфокальные серии срезов по оси Z (конфокальная система Nikon C2). Области измерения ядра инфаркта, Iba-1-положительных клеток, нейтрофилов и клеточных ядер, меченных введением концевой метки dUTP с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, стереотаксически количественно оценивали с помощью оптического фракционирующего зонда и программного обеспечения для количественной оценки нейроанатомических структур (Stereoinvestigator, MBF Bioscience; Виллистон, Вермонт). Изображения стриатума в аксиальной плоскости, окрашенные NF200, количественно оценивали по профилям интенсивности, созданным с помощью программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения).

Поведение

Походку и функции передних конечностей оценивали с помощью теста ходьбы по сетке и теста pasta matrix task, как описано ранее [13–17] (см. подробные методы оценки поведения в дополнительных данных on-line).

Статистический анализ

Мышей произвольно распределили по группам лечения. Результаты тестов анализировали при ослеплении относительно наличия инсульта и возраста. Необхо...

С. Розензвеиг, С.Т. Кармичаел