Введение нейротрофического фактора головного мозга опосредовало дифференцировку олигодендроцитов и формирование миелина после субкортикального ишемического инсульта

Предпосылки и цель исследования. Трансляционные исследования начинают раскрывать важность трофических факторов в качестве терапии для восстановления клеток головного мозга. Целью данного исследования было изучение влияния нейротрофического фактора головного мозга (BDNF – brain-derived neurotrophic factor) на опосредование олигодендрогенеза и ремиелинизации после повреждения белого вещества при субкортиальном инсульте. Методы. Развитие ишемии у крыс индуцировали путем инъекции эндотелина-1. Через 24 часа крысам опытной и контрольной групп внутривенно вводили 0,4 мкг/кг BDNF или солевой раствор соответственно. Анализировали результаты функционального обследования, МРТ и целостность проводящих путей на изображениях трактографии. Содержание маркеров пролиферации (KI-67) и восстановления белого вещества (A2B5,2’,3’-циклический нуклеотид 3’-фосфодиэстеразы [CNPase], аденоматозного полипоза толстой кишки [APC], альфа рецептора тромбоцитарного фактора роста [PDGFR-α], маркера олигодендроцитов O4 [O4], транскрипционный фактор олигодендроцитов [Olig-2] и основного белка миелина [МВР]) через 7 и 28 дней. Результаты. У животных, получивших BDNF, функциональный дефицит через 28 дней после лечения был выражен меньше по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Несмотря на отсутствие различий между группами в размере поражения по результатам T2-МРТ через 7 и 28 дней, при проведении анализа результатов трактографии, выполненной с помощью диффузионно-тензорной методики визуализации, выявили значительно большую плотность проводящих путей через 28 дней в группе BDNF, чем в контрольной группе (р<0,05). Увеличение пролиферации клеток-предшественников олигодендроцитов наблюдали в группе BDNF через 7 дней (р<0,05). Наконец, уровни маркеров восстановления белого вещества (A2B5, CNPase и О4 через 7 дней; Olig-2 и МВР через 28 дней) были выше в группе BDNF, чем в контрольной группе (р<0,05). Выводы. Введение BDNF привело к лучшему функциональному исходу, способствовало олигодендрогенезу, ремиелинизации и восстановлению плотности проводящих путей волокон у крыс с субкортикальными повреждениями после ишемического инсульта.

После десятилетий проведения исследований, направленных на поиск методов лечения кортикальных инфарктов в экспериментальных моделях с повреждением преимущественно серого вещества, в нескольких трансляционных исследованиях стали подчеркивать важность изучения повреждения белого вещества после инсульта [1]. Считается, что ≤25% ишемических инсультов у людей являются субкортикальными или лакунарными и ограничиваются участками белого вещества головного мозга [2], но и при кортикальных инфарктах развивается повреждение белого вещества. Высокая частота развития этого повреждения обусловливает поиск эффективных методов лечения для усиления механизмов, лежащих в основе восстановления поврежденного белого вещества (аксоны и миелин) после инсульта [2].

Трофические факторы являются новым эффективным методом восстановительной терапии после инсульта, и они могут надежно обеспечивать создание благоприятной среды для восстановления клеток после повреждения головного мозга [3, 4]. Одной из таких заметных трофических молекул является нейротрофический фактор головного мозга (BDNF – brain-derived neurotrophic factor), который секретируется в зависимости от активности головного мозга и, главным образом, способствует синаптическому регулированию и пластичности аксонов, связан с обучением, памятью и восстановлением сенсомоторных функций [4, 5]. Кроме того, in vitro исследования с нокаутом BDNF показали, что этот трофический фактор оказывает прямое воздействие на олигодендроглию, обеспечивает пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников олигодендроцитов (КПО) и миелинизацию [6–8].

Все вышеизложенное позволяет предположить, что BDNF может оказать влияние на олигодендрогенез и ремиелинизацию после инсульта. Таким образом, в данном исследовании изучали возможное влияние введения BDNF на ремоделирование белого вещества посредством олигодендрогенеза и миелиногенеза и возможную корреляцию этого эффекта с функциональным восстановлением в модели субкортикального инсульта у животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Это трансляционное исследование провели в соответствии со всеми жесткими академическими стандартами изучения методов лечения инсульта в отношении рандомизации, ослепления и статистической мощности [9]. Кроме того, эксперименты были разработаны таким образом, чтобы свести к минимуму страдания животных в соответствии с требованиями нашего Этического комитета по уходу и использованию животных в исследованиях (Директивы ЕС 86/609/CEE и 2003/65/ CE). В общей сложности 74 взрослых крыс линии Sprague-Dawley (200–250 г) произвольным образом распределили в 3 группы: псевдовмешательство – операция без инъекции эндотелина-1+внутривенное введение солевого раствора (n=24); контрольная группа – субкортикальный инсульт+внутривенное введение солевого раствора (n=24) и BDNF – субкортикальный инсульт+внутривенное введение BDNF (n=24). В группе BDNF, рекомбинантный человеческий BDNF (Peprotech, Великобритания) разводили в физиологическом растворе до конечного объема 1 мл и вводили через хвостовую вену в дозе 0,4 мкг/кг через 24 часа после операции. Солевой раствор в том же объеме вводили животным контрольной группы и группы псевдовмешательства. Затем крыс случайным образом разделяли на три подгруппы, забивали через 4 часа (n=4 в каждой группе), на 7-й день (n=10 в каждой группе) или на 28-й день (n=10 в каждой группе). Двух крыс исключили из исследования, потому что одна умерла после операции, а другая – во время проведения магнитно-резонансной томографии.

Модель субкортикального инсульта с введением эндотелина-1

Физиологические параметры и температуру тела у всех животных непрерывно контролировали во время операции (дополнительные данные on-line). Для формирования повреждения белого вещества индуцировали развитие субкортикального инсульта у предварительно анестезированных крыс после небольшой краниотомии путем инъекции мощного вазоконстриктора, эндотелина-1, с использованием стереотаксического устройства со стереотаксическими координатами (+0,4 мм антеропостериорно, +3,5 мм латеральнее, +6 мм дорсовентральнее теменной области). Один микролитр эндотелина-1 (0,25 мкг/мкл) вводили со скоростью 0,2 мкл/мин. Сразу же после операции проводили обезболивание во всех группах путем внутрибрюшинной инъекции мелоксикама в дозе 2 мг/кг.

Количественный анализ BDNF после лечения

Количественное содержание BDNF определяли с использованием набора для иммуноферментного анализа содержания человеческого BDNF (Abcam) и вестерн-блоттинга в ткани головного мозга и сыворотке крови животных контрольной и опытной групп через 4 часа, 7 дней, и 28 дней (дополнительные данные on-line). Иммунофлуоресценция (с использованием первичных антител анти-BDNF [1:1000, Millipore] и вторичных антикроличьих антител Alexa Fluor 594 [1:750, Invitrogen]; n=4 в каждой группе).

Дж. Рамос-Цеюдо, М. Гутиéррез-Фернáндез, Л. Отеро-Ортега, Б. Родригез-Фрутос, Б. Фуентес, М.Т. Валлеё-Цремадес, Т.Н. Хернанз, С. Цердáн, Е. Диез-Теэдор