Микробиологическая эффективность в отношении уропатогенов биологически активной добавки Циурол Н: пилотное исследование

Актуальность. Биологически активные добавки (БАД) занимают важное место в лечении и профилактике инфекций мочевыводящих путей (ИМП). При этом их механизм действия зачастую остается неясен.
Цель исследования. Изучение антиадгезивной, антибиопленочной и прямой антибактериальной активности БАД Циурол Н в отношении уропатогенных бактерий – возбудителей ИМП.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились уропатогенные микроорганизмы (127 штаммов), выделенные из мочи 120 женщин с рецидивирующей ИМП. Были отобраны по 5 культур наиболее часто выявляемых уропатогенов: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis (всего 20 образцов). Антиадгезивную активность Циурола Н оценивали по изменению значения индекса адгезии (ИА), антибиопленочную активность – по изменению величины оптической плотности биопленок, прямой антибактериальный эффект – по количеству жизнеспособных бактерий после их взаимодействия с исследуемым продуктом с расчетом минимальной ингибирующей концентрации (МИК). Контрольные образцы были представлены суспензией бактерий в мясопептонном бульоне в концентрации 1х10² КОЕ/мл, а опытные образцы – смесью из бактерий в такой же стартовой концентрации с добавлением Циурола Н.
Результаты. В опытных образцах через 24 часа от начала исследования значения ИА по сравнению с контролем были ниже для E. coli в 2,4 раза, для K. pneumoniae – в 2,4 раза, для P. mirabilis – в 2,2 раза, а для E. faecalis – в 2,8 раза. В эти же сроки после добавления Циурола Н зарегистрированы меньшие значения оптической плотности биопленок в 2,2–2,8 раза по сравнению с контролем для всех изучаемых уропатогенов. Выявлено прямое антибактериальное действие Циурола Н, о чем свидетельствовало подавление роста колоний изучаемых микроорганизмов. В целом для всех уропатогенов стойкий антибактериальный эффект сохранялся на протяжении 9 часов наблюдения. Через 12 часов отмечается динамика нарастания количества жизнеспособных колоний, однако их количество было существенно меньше по сравнению с контролем.
Выводы. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии у БАД Циурол Н антиадгезивного, антибиопленочного и прямого антибактериального действия in vitro в отношении основных уропатогенов. Полученные данные целесообразно использовать при планировании исследований клинической эффективности Циурола Н у больных с ИМП.

Введение. Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) остаются важной проблемой современной урологии и медицины в целом. Это обусловлено как высокой распространенностью ИМП, их негативным влиянием на качество жизни больных, склонностью к рецидивированию, так и недостаточной эффективностью существующих методов лечения и профилактики [1–3]. Самой частой клинической формой ИМП является неосложненный цистит. Установлено, что по крайней мере однократно острый цистит переносят не менее 40% женщин, а у 25% из них рецидив ИМП отмечается в течение 6 месяцев после первого эпизода [1, 3].

Основными возбудителями неосложненного цистита являются грамотрицательные микроорганизмы кишечной группы – представители семейства Enterobacteriaceae. По данным исследования ДАРМИС-2023, среди возбудителей неосложненных ИМП преобладает Escherichia coli (77,1%), доля Klebsiella pneumoniae составляет 8,8%, Proteus mirabilis – 3,6% [4]. Уропатогенные бактерии обладают набором факторов вирулентности, обуславливающих их способность вызывать инфекцию нижних мочевыводящих путей (ИНМП). К ним относятся адгезины и специфические токсины (альфа-гемолизин, цитотоксический некротизирующий фактор 1, сидерофоры). Фимбриальные адгезины обеспечивают адгезию уропатогенов к поверхности эпителиальных клеток мочевого пузыря, а также способность бактерий проникать внутрь уротелиоцитов с образованием внутриклеточных бактериальных сообществ и биопленок [5]. Формирование бактериальных резервуаров в слизистой мочевого пузыря рассматривают как патогенетическую основу рецидивирования ИМП [6].

Исходя из бактериальной природы возбудителей ИМП, ведущим направлением лечения острого цистита является антибактериальная терапия [2, 3]. При этом отмечается не всегда достаточная эффективность антибактериальных препаратов, особенно при рецидивирующих формах ИМП. Также все более значимой становится проблема антибиотикорезистентности, что связано главным образом с нерацио­нальным и избыточным применением антибактериальных препаратов [4]. В этой связи все большее значение придается альтернативным неантибиотическим методам лечения и профилактики ИМП. К таковым относится применение фито- и иммунопрепаратов, пробиотиков, антиадгезинов, нестероидных противовоспалительных препаратов и ряда других [2, 7].

В последние годы у пациентов с рецидивирующими циститами все шире применяются биологически активные добавки (БАД). В отечественной аптечной сети представлено множество БАД, различающихся по своему составу и показаниями к применению. Большинство из них являются многокомпонентными и содержат растительные экстракты и биологически активные вещества, оказывающие влияние на разные стороны патологического процесса у больных с ИМП. В то же время значимой проблемой при использовании БАД зачастую является отсутствие представления об их механизмах действия, в частности, микробиологической эффективности. Без ясного понимания патогенетических основ применения БАД невозможно составить рациональную схему их назначения, установить оптимальные продолжительность применения и дозировку. Указанные обстоятельства послужили основанием для настоящего исследования, направленного на изучение микробиологических эффектов одного из широко используемых биологически активных продуктов у пациентов с ИМП – отечественной БАД Циурол Н. В его состав входят D-манноза (300 мг), экстракт плодов клюквы (150 мг), N-ацетилцистеин (100 мг), экстракт листьев толокнянки обыкновенной (содержание арбутина – 10%).

Цель исследования. Изучение антиадгезивной, антибиопленочной и прямой антибактериальной активности БАД Циурол Н в отношении уропатогенных бактерий – возбудителей ИМП.

Материалы и методы. Материалом для исследования явились уропатогенные микроорганизмы, выделенные из мочи 120 женщин с рецидивирующими ИМП. Забор образцов мочи проводили во время обострения цистита до начала лечения. Изучали образцы мочи пациенток, соответствующих следующим критериям: женский пол, возраст старше 18 лет, давность рецидивирующей ИМП не менее трех лет, наличие обострения цистита к началу исследования. Последнее диагностировали на основании жалоб, клинической картины, а также результатов общего анализа мочи (более 10 лейкоцитов в поле зрения при микроскопии осадка мочи). Критериями невключения были наличие осложненной ИМП, острого или активной фазы хронического пиелонефрита, полиурии, тяжелых сопутствующих соматических заболеваний, а также прием любых лекарственных препаратов с антибактериальной активностью в течение 4 недель до забора материала для микробиологического анализа.

На первом этапе исследования для выявления уропатогенов выполняли посев биоматериала (мочи) на чашки с кровяным, желточно-солевым агаром с последующей инкубацией в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. При первичной идентификации с использованием автоматического микробиологического анализатора из 120 образцов мочи были выделены 127 штаммов микроорганизмов: 106 (83,5%) – грамотрицательных и 21 (16,5%) – грамположительных. В 113 пробах мочи микроорганизмы были выделены в монокультуре, а в 7 образцах выявлены микст-инфекции: в 3 образцах мочи ассоциация Escherichia coli с Klebsiella spp и в 4 – с Enteroccocus spp.

На втором этапе проводили оценку микробиологических эффектов БАД Циурол Н. С этой целью были отобраны по 5 культур наиболее часто выявляемых уропатогенов: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis (всего 20 образцов).

Для оценки антибактериальной активности в отношении основных уропатогенов in vitro БАД Циурол Н готовили опытные и контрольные образцы. Контрольный образец представлял из себя суспензию бактерий в мясопептонном бульоне в концентрации 1х10² КОЕ/мл, а опытный образец – смесь из бактерий в такой же стартовой концентрации с добавлением исследуемой БАД.

Методика оценки антиадгезивной активности

Изучение антиадгезивных свойств Циурола Н проводили на клетках буккального эпителия по оригинальной методике А.С. Благонравовой и соавт. [8]. На экспериментальные и контрольные предметные стекла наносили клетки буккального эпителия и помещали их во влажную камеру в термостат при температуре 36–37°C. После подсыхания (через 3 часа) на поверхность экспериментальных стекол наносили по 100 мкл раствора Циурола Н в концентрации 300 мг/мл, распределяли по поверхности клеток и помещали в термостат, выдерживали 30 минут в термостате, затем излишки сливали. Далее на поверхность всех стекол наносили по 100 мкл бактериальной суспензии, содержащей 106 КОЕ/мл микроорганизмов. Стекла помещали в термостат при температуре 36–37°C на 24 часа. Затем после отмывки физиологическим раствором стекла окрашивали по Граму и просматривали на обычном световом микроскопе при увеличении в 1000 раз. Индекс адгезии рассчитывали по формуле: индекс адгезии = БК50 / 50Э, где БК50 – количество бактерий, прикрепившихся к 50 эпителиоцитам, 50Э – 50 изученных эпителиоцитов.

Методика оценки антибиопленочной активности

Модели биопленок изучаемых уропатогенов выращивали в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах. Планшеты инкубировали при температуре 36–37°С в течение 24 часов. Далее в экспериментальные лунки к зрелым биопленкам добавляли Циурол Н и оставляли в термостате при тех же условиях культивирования еще на 24 часа. После завершения инкубации из лунок полностью удаляли всю жидкость и промывали планшеты для удаления оставшихся планктонных клеток. Планшеты сушили, в лунки вносили краситель генциановый фиолетовый на 15 минут. По истечении времени планшеты промывали от несвязавшегося красителя и оставляли до полного высыхания. Для элюирования красителя использовали уксусную кислоту в концентрации 30%, которую вносили в окрашенные лунки на 15 минут, после чего удаляли и измеряли оптическую плотность при длине 490 нм с использованием фотометра.

Методика оценки прямой антибактериальной активности

Антибактериальную активность Циурола Н в отношении основных уропатогенов оценивали по количеству жизнеспособных бактерий после их взаимодействия с исследуемым продуктом. С этой целью готовили бактериальную суспензию 0,5 MF (McFarland Standard) из суточных культур, выросших на плотной питательной среде. После разведения в мясопептонном бульоне (МПБ) получали суспензию, содержащую 104 КОЕ/мл микроорганизмов. Содержимое капсулы Циурола Н растворяли в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Опытный образец представлял из себя суспензию бактерий в концентрации 1 •10² КОЕ/мл с добавлением Циурола Н, а контрольный образец – только суспензию бактерий в такой же стартовой концентрации. Далее выполняли высев газоном на чашки Петри с плотной питательной средой. Чашки Петри, опытные и контрольные пробирки помещали в термостат при температуре 36–37°C. Далее каждые 3 часа производились высевы из пробирок до 12 часов экспозиции (3, 6, 9, 12 часов) и окончательный высев через 24 часа. Проводили подсчет числа выросших колоний и анализ кинетических кривых роста. В качестве основного показателя выраженности антибактериальной активности использовали величину минимальной ингибирующей концентрации (МИК), то есть минимальной концентрации исследуемого продукта, подавляющую видимый рост микроорганизмов при его культивировании in vitro. Оценивали два показателя МИК: МИК50 – к данной концентрации Циурола Н чувствительно 50% исследуемых штаммов и МИК90 – чувствительно 90% исследуемых штаммов. Исследование проводили микрометодом в 96-луночных планшетах согласно текущим рекомендациями [9]. Уропатогенные микроорганизмы использовали в концентрации 1•106 КОЕ/мл. Исходный раствор Циурола Н получали путем растворения содержимого его капсулы в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Последующие разведения препарата получали путем разведения исходного раствора в 2 раза.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы STATISTICA 10En (StatSoft, Inc.). Средние значения показателей в тексте статьи указаны со средней ошибкой (M±m) для числовых показателей и n (%) для значений частот. Для оценки достоверности различия средних значений применяли параметрический критерий Стьюдента. Статистическую значимость различия частот оценивали с помощью критерия χ2. Нулевую статистическую гипотезу об отсутствии различий и связей отвергали при p<0,05.

Результаты. Антиадгезивная активность Циурола Н

В табл. 1 представлены результаты оценки антиадгезивной активности Циурола Н. В опытных образцах через 24 часа от начала исследования значения ИА по сравнению с контролем были ниже для E. coli в 2,4 раза, для K. pneumoniae – в 2,4 раза, для P. mirabilis – в 2,2 раза, а для E. faecalis – в 2,8 раза.

На рис. 1–4 наглядно представлен антиадгезивный эффект Циурола Н в отношении изучаемых уропатогенов. Заметно значительно меньшее число бактерий, прикрепившихся к эпителиальным клеткам в опытных образцах по сравнению с контролем.

Антибиопленочная активность Циурола Н

Для оценки антибиопленочной активности исследуемого продукта определяли оптическую плотность биопленок уропатогенов при добавлении Циурола Н. Отмечено, что в опытных образцах оптическая плотность биопленок оказалась статистически достоверно меньше, чем в контроле, что свидетельствовало об ингибировании Циуролом Н их роста. Через 24 часа от начала эксперимента зарегистрированы меньшие значения оптической плотности биопленок в 2,2–2,8 раза по сравнению с контролем для всех изучаемых уропатогенных микроорганизмов (табл. 2).

Прямое антибактериальное действие Циурола Н

Циурол Н обладает прямым антибактериальным действием в отношении уропатогенов, причем этот эффект выявлен для всех изучаемых микроорганизмов – E. coli, K. pneumonuae, P. mirabilis, E. faecalis. Об этом свидетельствует подавление роста колоний изучаемых уропатогенов (рис. 5–8). Уже через 3 часа эксперимента число колоний в опытных образцах было значимо меньше, чем в контроле. Данная тенденция отмечалась весь период 24-часового наблюдения для всех 4 изучаемых уропатогенов.

В табл. 3 представлена выраженность снижения числа колоний микроорганизмов под влиянием Циурола Н в зависимости от микроорганизма и сроков наблюдения.

Обращает на себя внимание различие в антибактериальном действии Циурола Н в зависимости от вида микроорганизмов. Так, наибольшее различие по числу колоний по сравнению с контролем отмечено для K. pneumoniae через 3 часа наблюдения (в 55,7 раза), для E. coli – через 6 часов (в 66,4 раза), для E. faecalis – через 9 часов (в 66,3 раза). В отличие от остальных микроорганизмов антибактериальная активность Циурола Н в отношении P. mirabilis была относительно невелика, однако разница в числе колоний в опытных и контрольных образцах сохранялась примерно на одном уровне в течение всех 24 часов наблюдения. В целом для всех изучаемых микроорганизмов стойкий антибактериальный эффект сохранялся на протяжении 9 часов наблюдения. Через 12 часов отмечается динамика нарастания количества жизнеспособных колоний, однако их количество было существенно меньше по сравнению с контролем. Наиболее выраженная разница по числу колоний в опытных и контрольных образцах через 12 часов отмечена для E. faecalis (в 42,7 раза). Через 24 часа эта разница в зависимости от вида микроорганизма составляла от 2,8 до 5,3 раза. В эти сроки наблюдения число колоний всех изучаемых уропатогенов во всех опытных образцах было меньше исходного уровня, однако значительно варьировало в зависимости от вида микроорганизмов. Наибольшая разница отмечена для E. faecalis – в 9,5 раза меньше исходного значения. Для грамотрицательных микроорганизмов разница была не столь существенна: для E. coli – в 1,7 раза меньше, для K. pneumoniae – в 2,1 раза меньше и для P. mirabilis – в 1,1 раза меньше.

Следующим этапом изучения прямого антибактериального эффекта Циурола Н была оценка МИК в отношении изучаемых уропатогенов (табл. 4).

Обсуждение. Результаты проведенного микробиологического исследования свидетельствуют о наличии у Циурола-Н антиадгезивного, антибиопленочного и прямого антибактериального эффектов in vitro. Антибактериальная активность выявлена для всех изучаемых микроорганизмов – E. coli, K. pneumonuae, P. mirabilis, E. faecalis. Установленное антибиотическое действие исследуемого продукта в отношении уропатогенов обусловлено свойствами входящих в его состав компонентов – D-маннозы, экстракта клюквы, N-ацетилцистеина и экстракта листьев толокнянки.

D-манноза представляет собой моносахарид, обладающий антиадгезивными свойствами и препятствующий прикреплению уропатогенных бактерий к уротелиоцитам [10]. Известно, что адгезия микроорганизмов к уротелиальным клеткам происходит за счет тропности бактериальных фимбриальных адгезинов FimH к белковым структурам на поверхности уротелиальных клеток. Основными рецепторами для FimH являются маннозосодержащий гликопротеин уроплакин 1а, гликопротеин Тамма–Хорсфалла, β1- и α3-интегрины [11]. Экзогенная D-манноза способна насыщать адгезины FimH, тем самым блокируя адгезию бактерий к этим рецепторам [5, 12].

Клиническая эффективность D-маннозы в лечении и профилактике рецидивирующих ИМП установлена в многочисленных исследованиях [13–16]. Однако работ, посвященных количественной оценке антиадгезивного потенциала продуктов, содержащих D-маннозу, относительно немного [17–19].

Экстракт клюквы, входящий в состав Циурола Н, относится к наиболее широко используемым средствам неантибиотического лечения и профилактики ИМП. Фармакологические свойства экстракта клюквы обусловлены содержащимися в нем флавоноидами, антоцианидинами, катехинами, тритерпеноидами и органическими кислотами [20]. Антиадгезивная активность клюквы обусловлена наличием в ней фруктозы, которая блокирует прикрепление фимбрий 1 типа, и проантоцианидинов, предотвращающих адгезию P-фимбрий [21]. Прямое антибактериальное действие экстракта клюквы связывают с содержащимися в ней органическими кислотам [22].

N-Ацетилцистеин является производным аминокислоты цистеина и широко известен как муколитик. Однако из-за высокой биологической активности использование N-ацетилцистеина вышло за пределы респираторной медицины. Доказано наличие у него антиоксидантного, противовоспалительного, радиопротективного и антибиопленочного действия [23]. Последний эффект обусловлен способностью N-ацетилцистеина разрывать дисульфидные связи мукополисахаридов, приводя к дезагрегации биопленок [24]. Нарушение структурной целостности биопленок делает образующие их уропатогенные бактерии доступными для антибактериальных агентов [25].

Экстракт листьев толокнянки широко используется для профилактики и лечения ИМП. Антимикробные и диуретические эффекты толокнянки связывают с арбутином и метиларбутином, которые расщепляются в организме до гидрохинона. Последний обладает прямым бактерицидным действием на уропатогены [26]. Усилению диуреза также способствуют содержащиеся в толокнянке флавоноиды, а дубильные вещества обеспечивают ее противовоспалительный эффект.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что выявленная в настоящем исследовании антиадгезивная активность Циурола Н связана с содержащимися в нем D-маннозой и экстрактом клюквы, антибиопленочное действие – с N-ацетилцистеином, а прямой антибактериальный эффект – с экстрактами клюквы и толокнянки. С точки зрения микробиологической эффективности в отношении уропатогенов состав Циурола Н является сбалансированным, позволяя синергично воздействовать на все звенья инфекционного процесса. Помимо установленного антибактериального действия компоненты Циурола Н обладают антиоксидантными, противовоспалительными, диуретическими свойствами, что предполагает патогенетическую обоснованность назначения данной композиции пациентам с ИМП.

Заключение. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о наличии у БАД Циурол Н антиадгезивного, антибиопленочного и прямого антибактериального действия in vitro в отношении основных уропатогенов. Высокая микробиологическая эффективность Циурола Н свидетельствует о сбалансированности компонентного состава данного продукта, содержащего D-маннозу, экстракт клюквы, N-ацетилцистеин и экстракт листьев толокнянки. Полученные в ходе экспериментальной работы данные целесообразно использовать при планировании исследований клинической эффективности Циурола Н у больных с ИМП.

Слесаревская М.Н., Кузьмин И.В., Краева Л.А., Смирнова Е.В.