Факторы энергетического метаболизма при задержке роста плода

Задержка роста плода (ЗРП) является актуальной проблемой современного акушерства [1]. В настоящее время существует множество работ, посвященных изучению данной проблемы. Несмотря на уже известные диагностические критерии, используемые для постановки диагноза ЗРП на антенатальном этапе, окончательный диагноз устанавливается только после рождения ребенка [2]. Поэтому продолжается поиск новых маркеров, позволяющих диагностировать данное осложнение во время беременности.

На сегодняшний день известны различные патогенетические механизмы и теории развития ЗРП; однако особый интерес вызывает теория фетального программирования, впервые предложенная Дэвидом Баркером [3]. Согласно данной теории, под воздействием различных неблагоприятных факторов внутриутробной среды происходят изменения в метаболических и иммунных процессах, приводящие к изменению направленности иммунного и метаболического реагирования, что формирует особенности метаболизма плода и новорожденного на протяжении всей последующей жизни и определяет предрасположенность к сердечно-сосудистым, неврологическим и другим заболеваниям, а также к ожирению и сахарному диабету [4].

В литературе описаны различные факторы, участвующие в регуляции энергетического метаболизма [5, 6]. Однако остается неизученной их роль в патогенезе ЗРП, взаимодействие друг с другом и вклад каждого фактора в развитие данного акушерского синдрома.

Поэтому важным является изучение содержания факторов, регулирующих энергетический метаболизм и объясняющих патогенетические механизмы развития данного осложнения беременности. Выше изложенное представляет большой научный интерес для диагностики ЗРП и послужило основанием для выполнения данной работы.

Цель исследования: изучить особенности содержания факторов энергетического метаболизма в плазме крови беременных при ЗРП и оценить их диагностическую значимость.

Материалы и методы

В ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Центр) было проведено когортное исследование, которое включало 59 беременных женщин.

Основная группа (I группа) включала 30 пациенток с подтвержденным постнатально диагнозом ЗРП. Группа контроля (II группа) – 29 женщин с физиологически протекающей беременностью без ЗРП по данным клинического обследования и результатам функциональных методов исследования.

Антенатально диагноз ЗРП устанавливался согласно критериям единого консенсусного документа по Дельфийской системе для ранней и поздней форм ЗРП. Постнатально массо–ростовые показатели оценивались согласно перцентильным шкалам INTERGROWTH-21 для доношенных и недоношенных детей [7]. При достижении массо-ростовых показателей новорожденного меньше 10-го процентиля устанавливался диагноз малого или маловесного к сроку гестации.

Отбор пациенток проводился по обращаемости в профильные отделения Центра. Для исключения влияния начала родовой деятельности на уровень изучаемых факторов энергетического метаболизма забор материнской крови проводился во время беременности вне родов. Все пациентки подписали информированное добровольное согласие на участие в исследовании. Проведенное исследование было одобрено на заседании локального Этического комитета Центра.

Критериями включения в исследование явились: срок беременности 22–40 недель, возраст от 18 до 45 лет, одноплодная беременность, осложнившаяся ЗРП (для основной группы), физиологически протекающая беременность (группа контроля), подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании, отсутствие регулярной родовой деятельности.

Критериями исключения послужили: наличие спонтанной родовой деятельности, многоплодная беременность, преэклампсия во время беременности, использование донорской яйцеклетки, тяжелая экстрагенитальная патология и антифосфолипидный синдром, острые инфекционные и генетические заболевания беременной женщины, пороки развития плода и гемолитическая болезнь плода.

Определение уровня факторов энергетического метаболизма (С-пептид, грелин, глюкозозависимый инсулинотропный полипептид (GlP), глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), глюкагон, инсулин, лептин, ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-I), резистин, висфатин) в плазме материнской крови проводилось мультиплексным методом. Для этого во время беременности вне родов производился забор венозной крови беременных женщин в вакуумные пробирки, содержащие этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), в объеме 5 мл. Обработка образцов осуществлялась в течение 30 минут после забора биологического материала. Для получения плазмы образцы венозной крови центрифугировали дважды при 500g и 5000g по 10 минут. Алликвоты объемом 500 мкл хранили при температуре -80°C.

Определение уровня факторов энергетического метаболизма в плазме проводилось согласно протоколу производителя с использованием стандартной тест-системы 10-plex Bio-Plex Pro Human Diabetes Panel (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) на системе Bio-Plex 200 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Обработка результатов проводилась с использованием приложения свойств Bio-Plex Manager 6.0 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Концентрация факторов представлена в нг/мл.

Статистический анализ

Статистический анализ и построение диаграмм выполнялись с использованием R (версия 4.0.2, R Foundation for Statistical Computing, Вена, Австрия) и OriginPro 8.5 (программное обеспечение OriginLab Corporation, Нортгемптон, Массачусетс, США). Для определения значимости различий для непрерывных величин использовали U-критерий Манна–Уитни. Сравнение качественных параметров проводилось с помощью точного критерия Фишера. Корреляции оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r_s). Данные представлены в виде медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1;Q3). Диаграммы на рисунках представлены в виде процентилей (min; 25; 50; 75; max). Качественные характеристики представлены в виде: абсолютных значений и процентных долей (количество образцов/общее количество образцов, %). Для оценки потенциальной диагностической ценности исследуемых параметров применяли метод логистической регрессии. С помощью метода логистической регрессии была определена значимость изученных факторов и построена модель. Вероятность наличия ЗРП рассчитывали по формуле: Р=1/(1+е^-z). Оценку качества полученной модели определяли путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой (AUC), а также расчета чувствительности и специфичности разработанной модели в точке порогового значения. Статистически значимые различия учитывали при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика включенных в исследование женщин представлена в таблице 1. Следует отметить, что все пациентки были сопоставимы по исходной клинико-анамнестической характеристике.

Возраст беременных в основной группе составил 34 (29; 38) года и 33 (29; 37) года в группе контроля (р=0,95). При оценке массо-ростовых показателей статистически значимых различий выявлено не было (р>0,05). Анализ исходного соматического здоровья пациенток не выявил статистически значимых различий. Анализ акушерского анамнеза показал, что среди повторнородящих статистически значимо чаще встречалась ЗРП в анамнезе в основной группе (6/15, 40%, р=0,002).

Оценка состояния по шкале Апгар новорожденных детей составила от 5 до 9 баллов. Массо-ростовые показатели новорожденных согласно перцентильным шкалам INTERGROWTH-21 статистически значимо различались в основной и контрольной группах. Масса тела при рождении у детей основной группы составила 1909 (1391; 2259,5) г., у детей из группы контроля – 3078 (2865; 3327,5) г (р<0,001). Процентиль массы тела после рождения составил 2,0 (1,0; 3,0) и 59 (46; 85) соответственно по группам при р<0,001.

Выявление наиболее значимых факторов, участвующих в регуляции энергетического метаболизма при ЗРП, проводилось вне родов для исключения влияния начала родового процесса на уровень исследуемых факторов. Уровни факторов энергетического метаболизма (нг/мл) в плазме материнской крови представлены в таблице 2.

Согласно представленным данным, наибольший интерес представляет изучение GLP-1 и PAI-1, поскольку при сравнении плазмы крови беременных в изучаемых группах были получены статистически значимые различия.

Уровень GLP-1 в основной группе был статистически значимо повышен относительно группы контроля (р=0,003) и составил 195,71 (113,26; 247,58) нг/мл, а у женщин с нормально протекающей беременностью – 125,84 (62,27; 168,24) нг/мл.

Похожая тенденция наблюдалась при изучении PAI-1. Его уровень также был статистически значимо повышен у пациенток с беременностью, осложненной ЗРП (р=0,004). Так уровень PAI-1 в основной группе составил 2739,93 (2310,4; 3313,15) нг/мл, а в группе контроля – 2354,97 (1739,48; 2526,83) нг/мл.

При изучении факторов энергетического метаболизма в течение беременности на сроках 26–40 недель было обнаружено резкое изменение уровня исследуемых факторов в сроке после 37 недель беременности. Учитывая выявленную тенденцию, уровень факторов был изучен в обеих группах до 37 недель и после 37 недель беременности; в связи с чем, все пациентки были разделены на две подгруппы в соответствии со сроком гестации. Результаты изученных факторов энергетического метаболизма в плазме крови беременных женщин с ЗРП и женщин с физиологически протекающей беременностью в зависимости от срока представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Факторы энергетического метаболизма в плазме материнской крови в группах до 37 недель и после 37 недель беременности (*р<0,05, **р<0,005).

Установлено, что при сравнении изученных факторов в плазме крови женщин с и без ЗРП в сроке до 37 недель беременности статистически значимые различия были получены при изучении уровней лептина (р=0,05) и PAI-1 (p=0,006).

При изучении PAI-1 обнаружено, что его уровень был статистически значимо повышен у пациенток с беременностью, осложненной ЗРП в сроке до 37 недель (р=0,006). Так уровень PAI-1 в основной группе составил 2718,11 (2329,29; 3117,11) нг/мл, а в группе контроля – 2344,68 (1636,21; 2532,66) нг/мл.

Уровень лептина в основной группе был статистически значимо снижен относительно контрольной группы (р=0,05) и составил 7048,32 (5125,95; 12904,13) нг/мл, а у женщин с нормально протекающей беременностью – 12276,41 (9747,23; 17202,28) нг/мл.

Нарушение регуляции лептина связано с аномальным внутриутробным ростом плода и последующим низким весом плода при рождении [8]. Нормальный рост плода зависит от сложных взаимодействий между материнской, плацентарной и внутриутробной средой. Лептин представляет собой пептидный гормон, наиболее известный своей ролью в энергетическом гомеостазе и секреции из жировой ткани, однако во время беременности, в основном, секретируемый плацентой [9]. Так, лептин, вырабатываемый тканями плаценты и адипоцитами матери и плода, играет неотъемлемую роль в росте плода при нормальной беременности и имеет решающее значение для развития и функционирования плаценты; регулирует образование бластоцисты и играет важную роль в имплантации и плацентации [10–12]. Согласно данным литературы, беременность – это состояние гиперлептинемии у матери, которое тесно связано с резистентностью матери к инсулину и мобилизацией питательных веществ из жировых запасов матери для удовлетворения энергетических потребностей растущего плода [13]. Как известно, уровень лептина постепенно увеличивается с прогрессированием беременности и достигает своего пика в III триместре беременности. Из-за молекулярной массы лептина материнский лептин не может свободно проникать через плацентарный барьер и, таким образом, не влияет на уровень лептина в плаценте, околоплодных водах или пуповинной крови [13].

В исследованиях сообщалось как о более низких [14], так и о более высоких [15, 16] уровнях материнского лептина у пациенток с новорожденными с ЗРП, по сравнению с новорожденными, соответствующими гестационному возрасту. Другие исследования не обнаружили корреляции между уровнем лептина у матери и массой плода. В нашем же исследовании уровень лептина был статистически значимо снижен у женщин с беременностью, осложненной ЗРП, что указывает на возможную роль лептина в развитии данного осложнения беременности, однако это требует дальнейшего изучения с проведением корреляционного анализа материнского, плодового и плацентарного лептина для уточнения механизмов формирования ЗРП.

После 37 недель беременности статистически значимые различия были получены при изучении GLP-1 и глюкагона в плазме крови беременных обеих групп (p=0,005 и р=0,01, соответственно).

Уровень GLP-1 у беременных с ЗРП в сроке после 37 недель был статистически значимо повышен относительно группы контроля (р=0,005) и составил 219,76 (140,17; 326,18) нг/мл, а у женщин с нормально протекающей беременностью – 83,63 (1,3; 144,56) нг/мл.

Похожая тенденция была обнаружена при изучении глюкагона. Его уровень также был статистически значимо повышен в основной группе (р=0,01) и составил 5023,19 (3705,38; 6539,45) нг/мл, а в группе контроля – 3296,34 (1382,64; 3479,17) нг/мл.

Известно, что GLP-1, связываясь со своими рецепторами в поджелудочной железе, вызывает секрецию инсулина [17, 18]. Чтобы оценить влияние GLP-1 на секрецию инсулина при ЗРП в сроке после 37 недель нами было изучено отношение инcулин/GLP-1 в основной и контрольной группах. Установлено, что при ЗРП отношение инcулин/GLP-1 значительно снижено (p<0,001) и составляет 1,03 (0,63;2,06), в отличие от контрольной группы, где значение равно 2,49 (1,58;7,08) (рис. 2).

Рис. 2. Взаимосвязь инсулина и GLP-1 при наличии и отсутствии ЗРП.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что у женщин с беременностью, осложненной ЗРП, наблюдается резистентность к GLP-1 на уровне рецепторов клеток поджелудочной железы, приводящая к повышению секреции GLP-1 в плазме крови в течение беременности [19].

Повышенный уровень GLP-1 при ЗРП может оказывать влияние на различные процессы в организме матери [20]. Известно, что при связывании с GLP-1R синтезируется циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), активирующий в свою очередь цАМФ-зависимую протеинкиназу (PKA), которая позитивно регулирует экспрессию PAI-1 [21]. Это подтверждается статистически значимой прямой корреляционной связью между уровнями GLP-1 и PAI-1 в основной группе (коэффициент корреляции Спирмена, r_s=0,35 при р=0,05). В контрольной группе статистически значимой корреляции получено не было (r_s=-0,22, р=0,25). 

Повышение уровня PAI-1 (ингибитора фибринолиза) в крови беременной женщины может непосредственно приводить к ЗРП за счет повышенной продукции и накопления фибрина в эндотелии спиральных маточных артерий [22]. Как известно, во время беременности в системе гемостаза происходят большие изменения, затрагивающие маточно-плацентарный кровоток. Эндоваскулярная инвазия клеток трофобласта вызывает физиологическую адаптацию спиральных маточных артерий, необходимую для обеспечения повышенного притока крови к межворсинчатому пространству по мере пролонгирования беременности [23]. Большая часть сосудистого эндотелия и подлежащих гладких мышц заменяется трофобластами, а фибрин или фибриноид формируют основной морфологический субстрат стенок спиральных артерий [24]. По сравнению с эндотелиальными клетками,  трофобласт обладает сниженной способностью к лизису фибрина. Ранее проведенные исследования показали, что данное изменение связано с повышением уровня PAI-1 и PAI-2. Известно, что при беременности, осложненной ЗРП, наблюдается ограниченная физиологическая адаптация спиральных маточных артерий, что приводит к различным сосудистыми поражениям, в том числе,  к развитию плацентарной недостаточности за счет более высокого отложения фибрина, что объясняется высокой концентрацией PAI-1 в материнской крови и в плаценте и снижением активности активатора плазминогена,  по сравнению с клетками трофобластов при нормальной беременности [22, 24]. Локальное повышение уровня PAI-1 на ранних сроках может играть важную роль в ограничении инвазии трофобласта, увеличении отложения фибрина и впоследствии,  снижении маточно-плацентарного кровотока, что может привести к развитию ЗРП [23].

В нашем исследовании уровень PAI-1 был статистически значимо выше в плазме крови беременных с ЗРП, что подтверждает данные литературы и указывает на значимую роль PAI-1 в недостаточной плацентации на ранних сроках беременности, а впоследствии и нарушении маточно-плацентарного кровотока у данного контингента пациенток.

Для оценки диагностической ценности методом логистической регрессии из 10 изученных факторов энергетического метаболизма условным методом были выбраны 5 факторов: GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин и PAI-1.  Формула логистической регрессии для выбранных факторов представлена ниже:

P=1/(1+е^-z),

Z=4,79+[GLP-1]*(-0,014)+[Глюкагон]*(-0,0014)+[Инсулин]*0,005+ +[Лептин]* 0,0005+[PAI-1]*( -0,0012),

где P – вероятность наличия ЗРП, е – основание натурального логарифма и имеет значение 2,718; [GLP-1], [Глюкагон], [Инсулин], [Лептин], [PAI-1] – значение уровней факторов энергетического метаболизма (нг/мл) в плазме материнской крови, представленные в таблице 2.

Для оценки диагностической значимости выбранных факторов был проведен ROC-анализ (рис. 3). Установлено, что площадь под ROC-кривой для комбинации из 5 факторов составила 0,92 (95% ДИ: 0,87–0,98) с оптимальным пороговым значением 0,36, чувствительностью 96% и специфичностью 81%, прогностической ценностью положительного результата 81% (95% ДИ: 70,7–89,7) и прогностической ценностью отрицательного результата 79,3% (95% ДИ: 62,2–93). При оптимальном пороговом значении менее 0,36 женщин следует относить в группу риска по развитию ЗРП. Согласно экспертной шкале, изучение таких факторов энергетического метаболизма, как GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин и PAI-1, обладает «отличной» диагностической ценностью, и их комбинацию можно рассматривать в качестве потенциальных маркеров для диагностики ЗРП на антенатальном этапе.

Рис. 3. ROC-кривая диагностики ЗРП на основании определения факторов энергетического метаболизма (GLP-1, глюкагона, инсулина, лептина и PAI- 1) в плазме материнской крови

Заключение

В проведенном исследовании были выявлены статистически значимые различия факторов энергетического метаболизма между группами пациенток с беременностью, осложненной ЗРП, и физиологически протекающей беременностью. Полученные результаты указывают на возможность участия факторов энергетического метаболизма в формировании ЗРП и перспективность их дальнейшего изучения. Так, статистически значимое повышение уровней GLP-1 и PAI-1 в плазме крови у женщин с ЗРП позволит использовать их в качестве новых неинвазивных маркеров в диагностике данного осложнения при беременности.

Несмотря на созданные диагностические панели и известные диагностические критерии, постановка диагноза ЗРП все еще остается затрудненной. Определение комбинации факторов энергетического метаболизма (GLP-1, глюкагон, инсулин, лептин и PAI-1) позволяет выявить развитие ЗРП с высокой диагностической ценностью, что позволит улучшить тактику ведения пациенток на антенатальном этапе.

Следует отметить необходимость продолжения исследования на большей выборке с проведением корреляционного анализа концентрации изучаемых факторов энергетического метаболизма в материнской и пуповинной крови для уточнения патогенетических механизмов ЗРП.