Клиническая и биологическая эффективность использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий

С появлением технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у человека в 1978 г. врачи и исследователи с нестабильным успехом пытаются увеличить частоту наступления клинической беременности, однако и сегодня она не превышает 35–40% в расчете на перенос эмбриона в полость матки с учетом криоциклов. Становится все более понятным, что существенно повысить эффективность лечения мужского и женского бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) можно лишь на эмбриологическом этапе программы. Свободной валентностью остается совершенствование способов отбора сперматозоидов и эмбрионов. Если с эмбрионами введение методов преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) позволяет увеличить частоту наступления беременности на 10–15%, то с методами селекции мужских половых клеток вопрос остается открытым и требует применения более фундаментальных технологий и междисциплинарного подхода.

В современной лаборатории ВРТ для обработки эякулята перед оплодотворением и выделения фракции морфологически нормальных подвижных сперматозоидов используются следующие методы: высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотностей на коммерческих культуральных средах и метод «всплытия» (swim-up), когда используется гаметный буфер. Согласно протоколам работы с гаметами человека, оба метода требуют центрифугирования образца спермы при высоких скоростях (300g), что может оказывать отрицательное влияние на целостность ДНК мужских половых клеток, а также приводить к формированию в образце активных форм кислорода, которые могут снижать оплодотворяющую способность сперматозоидов, вызывая фрагментацию их ДНК [1]. В качестве перспективного метода селекции мужских половых клеток в программах лечения бесплодия микрофлюидные системы привлекают внимание врачей и исследователей из-за их способности отбирать сперматозоиды с повышенным потенциалом к оплодотворению [2–4].

Основная идея микрожидкостного устройства для отбора мужских половых клеток заключается в сборе наиболее подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов для повышения вероятности оплодотворения, увеличения числа бластоцист хорошего качества и успешного наступления беременности. Все разработанные устройства можно разделить на две группы. Первая группа – активные микрофлюидные устройства, использующие внешние силы, такие как оптические ловушки, электрофорез и гидростатическое давление [5]. К сожалению, названные методы не подходят для выделения пригодных для ЭКО сперматозоидов, поскольку являются слишком инвазивными. Кроме того, для применения этих активных методов требуются сложные экспериментальные установки, что делает их трудоемкими и длительными. Во второй категории – пассивных микрофлюидных системах – процесс разделения основан на присущем сперматозоидам поведении, таком как «следование за границей разделения сред» и «реакция на внешние стимулы», такие как поток жидкости, температура и химические градиенты [1]. Пассивные системы могут разделять сперматозоиды без нарушения их морфологии и целостности ДНК, имитируя среду in vivo, что позволяет отбирать лучшие и наиболее компетентные сперматозоиды [6].

В настоящее время для использования в клинической практике на территории России разрешены микрожидкостные чипы FertilСhip турецкого производства. Именно они были использованы в текущем исследовании. В статье Aydin и Deniz (2022) было показано, что технология отбора сперматозоидов на основе микрофлюидных жидкостей позволяет отбирать сперматозоиды с меньшим количеством повреждений ДНК [2]. Согласно результатам исследования, показатели оплодотворения и качества эмбрионов были сопоставимы в группах с использованием чипа и при стандартной обработке сперматозоидов на градиенте плотностей. При этом в исследуемой группе наблюдалось большее количество живорождений, имплантаций и клинических беременностей. Это может свидетельствовать о том, что с помощью Fertile Chip была отобрана сперма более высокого качества или что другие параметры, влияющие на качество эмбрионов, не отражаются в морфологии сперматозоидов [2].

В связи с вышесказанным, целью настоящего исследования послужила оценка клинической эффективности использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов в программах лечения бесплодия методами ВРТ, а также анализ морфофункциональных характеристик мужских гамет, отобранных с помощью микрофлюидики.

Материалы и методы

В настоящее исследование было включено 94 супружеских пары (основная группа, n=47), проходящих лечение бесплодия в Отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени профессора Б.В. Леонова ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ в 2024 г. Все участники не имели ограничений и противопоказаний к лечению бесплодия методами ВРТ и подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Супружеские пары были обследованы согласно клиническим рекомендациям «Женское бесплодие» (2021). Критерии включения со стороны женщины: возраст от 18 до 40 лет, сохраненный овариальный резерв, подтвержденный гормонально и с помощью ультразвукового исследования; регулярный менструальный цикл; нормальный кариотип; отсутствие маточного фактора бесплодия; фактор мужского бесплодия, требующий проведения оплодотворения методом интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ). Критерии включения со стороны мужчины: объем эякулята >1,5 мл; концентрация сперматозоидов >5 млн/мл; прогрессивно-подвижных PR%>15%, нормальный кариотип, отрицательный результат на инфекции из уретры. Критерии исключения: использование донорских гамет и суррогатного материнства; аномалии строения внутренних органов, некомпенсированные эндокринопатии; оплодотворение сперматозоидами, выделенными из придатка или ткани яичка; наружный генитальный эндометриоз III–IV стадии распространения.

Стимуляцию функции яичников женщинам проводили по стандартному короткому протоколу препаратами гонадотропинов, в качестве триггера был применен хорионический гонадотропин человека в дозе 10 000 МЕ. Пункцию фолликулов выполняли под общей анестезией атравматичными иглами (Vitrolife, Швеция). Эмбриологический этап проводили на культуральных средах LifeGlobal (Origio, США). Перенос эмбриона в полость матки осуществляли катетерами СООК (Ирландия). Отмена переноса осуществлялась при проведении программы преимплантационного генетического тестирования (20 пациентов из основной группы). Группу сравнения (n=47) набирали согласно критериям включения/исключения из пациентов, проходивших лечение бесплодия методами ВРТ в тот же период времени. В основной группе эякулят обрабатывали согласно инструкции производителя микрожидкостных чипов FERTILE PLUS (Турция), в группе сравнения – с помощью отмывки в градиенте плотностей по протоколу производителя (ПанЭКО, Россия).

Для оценки морфофункциональных характеристик брали эякулят только мужчин основной группы (n=47). Пробоподготовку эякулята осуществляли следующим образом. После полного разжижения спермы в течение 20–30 минут всю порцию тщательно перемешивали аккуратным пипетированием стерильной пипеткой Пастера и делили на три аликвоты: 1-я аликвота – нативный эякулят, 2-я аликвота – группа основная, микрожидкостные чипы, FERTILE PLUS (Турция) и 3-я аликвота – группа сравнения, центрифугирование в градиенте плотностей (ПанЭКО, Россия) согласно инструкции производителя. Оценивали концентрацию (С), подвижность (PR%), морфологию (N, %) и зрелость хроматина сперматозоидов (%). Анализ сперматозоидов на ядерный белок (зрелость/конденсация хроматина) выполняли посредством окрашивания анилиновым синим (Sperm Processor, Индия).

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ SPSS Statistics (США), для выявления различий между группами применяли U-тест Манна–Уитни и Хи-квадрат для описательной статистики. Данные представлены как Me (Q1;Q3). В качестве критериев клинической эффективности применения микрожидкостных чипов использовали первичные изучаемые исходы: частота оплодотворения (число зигот 2PN2PB/число зрелых ооцитов MII) и частота бластуляции (число бластоцист на 5–6-е сутки культивирования/число зигот 2PN2PB); и вторичные исходы: частота наступления клинической беременности (число подтвержденных ультразвуковым исследованием беременных/число переносов эмбриона в полость матки) и частоту ранних репродуктивных потерь до 12 недель гестации (число неразвивающихся беременностей/число беременных). Для сравнения бинарных данных мерой сравнения служил ОР (относительный риск) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). На втором этапе исследования критерием биологической эффективности (конечной точкой) считали содержание сперматозоидов с незрелым хроматином (%). Уровень p<0,05 считали пороговым.

Результаты

На первом этапе было проведено сравнение групп набранных пациентов по клиническим характеристикам (табл. 1). Набранные супружеские пары не отличались по возрасту супругов, индексу массы тела (ИМТ) женщины. Стимуляция функции яичников была выполнена одинаковыми дозами гонадотропинов: в группе с микрофлюидными чипами средняя курсовая доза составила 1981 (553) МЕ, в группе сравнения – 1960 (770) МЕ. Статистически значимой разницы по числу дней стимуляции  между группами не было. В группе с селекцией на микрожидкостных чипах при трансвагинальной пункции фолликулов было получено 8,3 (3,2) ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), из них зрелых на стадии MII находились 6,1 (2,2) ооцита, а в группе сравнения у пациенток было получено 7,2 (3,1) ОКК, из них 5,0 (2,4) находились на стадии второго деления мейоза (MII) (табл. 1). Значимых отличий между результатами получения женских половых клеток в программе ВРТ выявлено не было, что позволило провести сравнение остальных показателей эмбриологического этапа.

В таблице 2 показаны причины бесплодия у обратившихся супружеских пар. Между пациентами основной группы и группы сравнения достоверных отличий найдено не было. Преимущественно в обеих группах преобладал трубно-перитонеальный фактор бесплодия, далее сочетанный фактор и изолированный мужской фактор бесплодия в виде нарушений сперматогенеза (невыраженных). Показатели спермограммы набранных в исследование мужчин представлены в таблице 3. Основная группа с селекцией на микрофлюидных чипах значимо не отличалась от группы сравнения по концентрации сперматозоидов в мл эякулята (в среднем, концентрация составляла 48 млн/мл и 53 млн/мл, соответственно). Процент прогрессивно-подвижных сперматозоидов (PR%) в группе с микрожидкостными чипами составил 61%, в группе сравнения – 58,5%, разница статистически не значима, группы сопоставимы. По морфологии мужских половых клеток группы также не различались.

При оценке параметров раннего эмбриогенеза было выявлено достоверное увеличение числа бластоцист отличного и хорошего качества в группе, где оплодотворение осуществляли сперматозоидами, выделенными на микрожидкостных чипах (табл. 4). В группе сравнения данный показатель составил 2 (1;2), в основной группе – 3 (2;4) (p<0,05). По остальным критериям – частота оплодотворения, число бластоцист на 5–6-е сутки культивирования – группы между собой не отличались. Клинические исходы программ лечения бесплодия методами ВРТ показаны в таблице 5. Как видно, значимой разницы выявлено не было.

Несмотря на отсутствие статистически значимой разницы в клинических исходах программ лечения бесплодия методами ВРТ в сравниваемых группах, была обнаружена положительная тенденция к увеличению частоты наступления беременности: с 30,6% в группе сравнения к 51,8% в группе, где использовали микрофлюидные чипы. Данные требуют большего числа пациентов и продолжения исследований.

На втором этапе исследования были оценены морфофункциональные характеристики мужских половых клеток, отобранных методом микрожидкостных устройств. Результаты представлены в таблице 6. Концентрация сперматозоидов в нативном эякуляте составила: 48 (33;70,5), 24 (10;33,5) – в группе микрожидкостных чипов и 28 (18,5;41,5) – в группе градиента. Подвижность (PR): группа натив – 61 (52,5;67,5), микрожидкостные чипы – 92 (88;95) и группа обработки в градиенте плотностей – 88 (77,5; 91,5). Разница в данных по концентрации и подвижности была статистически не значима. Отличия по выделению морфологически нормальных сперматозоидов оказались статистически значимыми (p<0,05): натив – 2 (2;3); микрожидкостные чипы – 3 (3;4) и группа градиента – 3 (3;3). Также значимо отличалось качество хроматина выделенных сперматозоидов: % незрелых сперматозоидов в нативном эякуляте составлял 14 (8;20), группа чипов – 3 (5,5;12) и группа градиента – 8 (5;10) при норме не более 15%. Таким образом, можно говорить о том, что использование микрофлюидных устройств для селекции сперматозоидов позволяет не только избежать центрифугирования мужских половых клеток, но и отобрать более компетентные сперматозоиды по зрелости хроматина.

Обсуждение

Как показали результаты проведенного исследования, селекция сперматозоидов с помощью микрожидкостных чипов может улучшить клинические результаты программ лечения бесплодия методами ВРТ. Отбор сперматозоидов с помощью микрофлюидных чипов привел к значимому увеличению числа бластоцист отличного и хорошего качества. Данный факт может рассматриваться как позитивный, поскольку увеличение числа криоконсервированных эмбрионов позволит провести большее число переносов бластоцист в полость матки, при этом избежать нового протокола ЭКО со стимуляцией функции яичников, тем самым снизив гормональную нагрузку на организм женщины.

Была показана лишь тенденция к увеличению частоты наступления клинической беременности. Данные требуют накопления и дальнейшего изучения по популяции российских бесплодных пар. В России было опубликовано единственное исследование, в котором было показано преимущество микрожидкостных чипов при оценке клинической эффективности [5]. Авторы выявили положительные тенденции к улучшению эмбриологических показателей программ ВРТ, а также предполагают, что именно такой метод сортировки сперматозоидов позволяет получать гаметы лучшего качества.

В зарубежных публикациях данные об эффективности микрожидкостных чипов противоречивы. Например, было проведено проспективное рандомизированное контролируемое исследование с участием 386 пациенток, планирующих ЭКО [7]. У пациентов, рандомизированных для микрофлюидной подготовки спермы, авторы наблюдали такое же качество эмбрионов на стадии дробления и бластоцисты, а также такие же показатели клинической и продолжающейся беременности, как и у тех, кто прошел стандартную обработку спермы для ЭКО с ИКСИ [7]. При этом в другом исследовании авторы говорят об увеличении частоты оплодотворения в группе микрофлюидных чипов; при этом снижения числа анеуплоидных эмбрионов у пациентов с бесплодием в программах ВРТ не наблюдали [8].

Следует отметить, что дальнейшие исследования должны быть направлены на изучение вопроса целесообразности использования микрофлюидных устройств при повышенной ДНК-фрагментации сперматозоидов. Может ли такая технология, избежав центрифугирования, которое, как известно, приводит к нарушению целостности ДНК, отобрать мужские гаметы с целой ДНК? Если да, то именно микрофлюидные чипы могут помочь таким супружеским парам снизить частоту невынашивания, которое характерно для таких супругов [9].

В настоящем исследовании было убедительно показано, что использование микрофлюидных чипов приводит к отбору аликвоты сперматозоидов с нормальным зрелым хроматином. Этот результат является крайне важным, поскольку именно надлежащая компактизация обеспечивает целостность ДНК, что важно для последующего эмбрионального развития. Многие авторы пишут о том, что именно благодаря микрофлюидным технологиям возможен прорыв в области ВРТ [10,11]. Кроме того, микрофлюидные чипы могут быть спроектированы так, чтобы комбинировать различные подходы для получения высокоэффективных устройств для разделения сперматозоидов — хемотаксис, пассивный или активный реотаксис, термотаксис [11–15].

Заключение

Полученные в настоящем исследовании результаты указывают на увеличение не только морфологически нормальных сперматозоидов, отобранных на микрожидкостных чипах, но и на повышение доли мужских половых клеток с нормально упакованным хроматином. Это является значимым результатом для дальнейшей оценки использования микрожидкостных чипов в клинической практике, поскольку именно целостность ДНК сперматозоидов крайне важна для пролонгирования беременности, полученной в результате лечения методами ВРТ. Также возможно ожидать улучшение эмбриологических показателей при селекции сперматозоидов без центрифугирования, только с использованием устройств с микрофлюидикой (в том числе пассивной).