NK-клетки периферической крови у пациенток с рубцом на матке и плацентарной адгезивно-инвазивной патологией

На сегодняшний день патогенетические механизмы развития плацентарной адгезивно-инвазивной патологии (ПАИП) остаются не до конца изученными [1]. Основным предиктором развития ПАИП считается рубец на матке после кесарева сечения в анамнезе, однако не во всех случаях развивается аномальная инвазия плаценты. По мнению ряда авторов,  в основе нарушения ангиогенеза и гиперваскуляризации лежит нарушение иммунологической толерантности на границе мать-плацента-плод [2].

NK-клетки (natural killer cells, естественные клетки киллеры)  являются компонентами врожденной иммунной системы, которые обеспечивают защиту от инфекций и развития опухолей, однако их функции при беременности очень разнообразны [3].

uNK-клетки (uterine natural killer cells, маточные NK-клетки) опосредуют баланс между активацией и угнетением инвазии вневорсинчатого трофобласта (ВВТ), регулируют ремоделирование спиральных артерий путем синтеза многочисленных хемокинов, цитокинов а также благодаря цитотоксической функции [4].  Поскольку uNK-клетки участвуют в ключевых этапах децидуализации, имплантации и плацентации, широкое распространение получили исследования периферических и тканевых NK-клеток при патологии беременности [5]. 

Традиционным является представление о том, что у пациентов с привычным невынашиванием повышено содержание uNK-клеток [6, 7]. Исследования показали, что увеличение uNK-клеток у пациенток с привычным невынашиванием вызывает повышенную васкуляризацию и нарушение ремоделирования спиральных артерий, что приводит к преждевременному усилению плацентарного кровотока и чрезмерному окислительному стрессу и, как следствие, к прерыванию беременности [8]. Другие авторы указывают на повышение активности pNK-клеток (периферических NK-клеток крови) при бесплодии или привычном выкидыше [9].  В то же время,  в литературе встречаются убедительные данные о том, что дефицит NK-клеток или изменение их функции в сторону повышения синтеза фактора некроза опухоли (TNF)α и интерферона (IFN) γ и снижения секреции сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и плацентарного фактора роста (PLGF) приводит к нарушению ремоделирования сосудов при преэклампсии [10].

Учитывая имеющиеся данные о повышении сывороточных проангиогенных и снижении антиангиогенных факторов при ПАИП, которые в I триместре беременности синтезируются NK-клетками [8], интерес представляет изучение и оценка функции NK-клеток при аномальной инвазии плаценты. Изменение плотности uNK-клеток в зоне маточно-плацентарного комплекса при ПАИП описано в единичных работах [11–13].

Единое происхождение uNK- и pNK-клеток путем дифференцировки из гемопоэтических клеток in situ, а также сходство их фенотипических характеристик [14] позволяет использовать pNK-клетки для изучения взаимодействия с клетками хориона. Но, конечно, следует учитывать и различия рNK и uNK-клеток, касающиеся мембранных рецепторов CD16 и CD56.

Цель исследования: оценить цитотоксическую активность NK-клеток периферической крови беременных в отношении клеток трофобласта при ПАИП.

Материалы и методы

В контролируемое поперечное исследование с ретроспективным анализом включено 18 женщин в сроках 28–32 недели беременности. Основную группу составили 6 пациенток с рубцом на матке после кесарева сечения и ПАИП. В группы сравнения и контроля включены 6 беременных женщин с рубцом на матке без признаков приращения плаценты и 6 беременных женщин без рубца на матке, соответственно.

Критерии включения в исследование: возраст пациенток на момент включения 25–45 лет, спонтанно наступившая беременность, хорион по передней стенке матки по данным I скрининга, наблюдение в женской консультации с 11 недель беременности, подписание добровольного информированного согласия. Критерии невключения: использование вспомогательных репродуктивных технологий, привычный выкидыш, истмико-цервикальная недостаточность, плацентомегалия, существовавший ранее или развившийся во время беременности сахарный диабет, гипертензивные заболевания, преэклампсия, хроническая сердечная недостаточность, хроническая болезнь почек, антифосфолипидный синдром, обострение хронических и острые воспалительные заболевания.

Критериями включения в основную группу явились ультразвуковые и магнитно-резонансные признаки приращения плаценты: согласно действующим протоколам ведения беременности с аномалиями плацентации [15, 16].

Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» Минздрава России.

Ультразвуковое исследование выполнено на аппарате Voluson E10, GE Healthcare. Пациенткам основной группы выполнена магнитно-резонансная томография  на аппарате с индукцией магнитного поля 1,5 Тл (Siemens, Германия) в сроки от 28 до 32 недель беременности в соответствии с рекомендациями, разработанными сотрудниками научно-исследовательской группы лучевых методов исследования в перинатологии и педиатрии ФГБУ НМИЦ им. В.А. Алмазова [17].

Включение пациенток в исследование осуществлялось на базе консультативно-диагностического отделения для женщин Перинатального Центра ФГБУ «НМИЦ им. В.А. Алмазова» в сроки 32–38 недель беременности после сбора анамнеза, общего и акушерского осмотра. Взятие венозной крови у пациенток проводилось утром натощак в вакуумную пробирку с гепарином.

Оценка цитотоксичекой активности NK-клеток периферической крови в отношении клеток трофобласта (JEG-3) проведена по методике, разработанной в отделе иммунологии и межклеточных взаимодействий НИИ АГиР им. Д.О. Отта (зав. отделом иммунологии и межклеточных взаимодействий, засл. деятель науки РФ, д.м.н., проф. С.А. Сельков). В качестве мишеней для NK-клеток использовали клетки трофобласта линии JEG-3 (АТСС, Manssas, VA, США), представляющие основные характеристики клеток трофобласта I триместра беременности. Клетки культивировали в среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мML-глутамина, 1% заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich, США). Мононуклеарные клетки периферической крови пациенток, содержащие NK-клетки, выделяли стандартным методом скоростного центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографина (Histopaque-1077, Sigma, США). Для эксперимента клетки трофобласта дезинтегрировали, обрабатывали сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) и инкубировали в течение 4 ч во влажной атмосфере при t=37°С при 5% CO₂ с мононуклеарными клетками периферической крови в соотношении «эффектор:мишени» 10:1. Часть клеток трофобласта инкубировали в аналогичной культуральной среде без добавления мононуклеарных клеток для определения базовой гибели клеток трофобласта. После инкубации клетки обрабатывали раствором пропидия иодида в концентрации 2 мкг/мл при 4°С в течение 10 минут. Анализ гибели клеток-мишеней проводили с помощью проточного цитофлуориметра FACSCantoll (Becton Dickinson, USA) (PI+) [18]

Статистический анализ

Статистический анализ проведен с помощью программы IBM SPSS Statistics Version 26.0. Количественные переменные проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка.  Количественные показатели с ненормальным распределением описаны с помощью медианы (Me) и межквартильного размаха (Q1–Q3). Сравнение групп выполнено с помощью критерия Краскела–Уоллеса с поправкой на множественные сравнения Бонферони.

Результаты

Беременные женщины исследуемых групп сопоставимы по возрасту, сроку беременности и паритету родов, но различаются по паритету беременностей, количеству внутриматочных вмешательств и операций кесарева сечения в анамнезе (таблица). Беременные основной группы (с рубцом на матке и ПАИП) имели в анамнезе большее количество беременностей (p=0,002), выскабливаний полости матки по поводу искусственного прерывания беременности (p=0,023) и операций кесарева сечения (p=0,02), чем женщины с нормальной беременностью, но не имели различий с группой сравнения. Угрожающий выкидыш в I триместре чаще встречался в основной группе, чем в группах сравнения и контроля (p=0,027).

При сопоставлении цитотоксической активности pNK-клеток в отношении клеток трофобласта в исследуемых группах выявлено, что цитотоксическая активность NK-клеток выше в группе здоровых беременных с интактным миометрием, чем у женщин с рубцом на матке (p=0,022). Однако по результатам настоящего исследования не получено данных о различиях цитотоксической активности в сравнении с основной группой (рисунок).

Рисунок. Цитотоксическая активность NK-клеток в исследуемых группах.

Обсуждение

Вопросы этиологии и патогенеза ПАИП на сегодняшний день остаются спорными. Участие uNK-клеток в процессе ремоделировании спиральных, радиальных артерий и инвазии клеток трофобласта [12, 19], позволяет заподозрить их дисфункцию при ПАИП.

По данным литературы выделяется две главные субпопуляции NK-клеток при беременности: в периферической крови беременных женщин 90% NK-клеток (pNK) в меньшей степени экспрессируют CD56 (CD56^dim) и в большей степени – CD16 (CD16^+bright). CD 16⁺ обладают сильной цитотоксической активностью в отношении опухолевых и вирус-инфицированных клеток. Преимущественная экспрессия CD56 (CD56^bright) характерна для uNK-клеток, или маточных киллеров, которые локализуются в децидуальной ткани и в эндометрии и производят цитокины TNFα и IFNγ  [20]. На границе мать-плацента плод в начале беременности uNK-клетки преобладают среди лимфоцитов, составляют 70% от общего количества лимфоцитов в эндометрии и постепенно снижаются ко II триместру [21]. Недавние исследования показали, что источником uNK-клеток являются предшественники pNK-клеток, что позволяет использовать последние для изучения функции при патологии беременности [22].

В присутствии клеток трофобласта NK-клетки способны изменять экспрессию мембранных рецепторов и, следовательно, свои функции [23]. Так, например, увеличение количества pNK-клеток с фенотипом CD56^dim, обладающих более высокой цитотоксической активностью, и снижение числа CD56^bright, а также повышение экспрессии активирующих рецепторов NKp46 и NKp30, перфорина и гранзимов pNK-клетками ассоциировано с привычным выкидышем [24].

Прежде всего, функциональные характеристики uNK-клеток зависят от взаимодействий с клетками-мишенями через ингибирующие или активирующие рецепторы [4]. Цитокины на границе мать-плацента-плод могут как усиливать, так и снижать цитотоксический потенциал NK-клеток [25]. С помощью неклассических белков главного комплкса гистосовместимости (MHC), таких как человеческие лейкоцитарные антигены (HLA)-C, HLA-G и HLA-E,  клетки трофобласта взаимодействуют с иммуноглобулиноподобными рецепторами клеток-киллеров (KIR), лейкоцитарными иммуноглобулиноподобными рецепторами (LILR) и рецепторами естественной киллерной группы (NKG2), и изменяют функцию uNK-клеток [26]. Когда клетки ВВТ, которые экспрессируют HLA-C и HLA-E, взаимодействуют с KIR и NKG2-рецепторами на uNK-клетках, они блокируют цитотоксический ответ NK-клеток на инвазивный трофобласт [4]. С другой стороны, клетки ВВТ с экспрессией HLA-C, при взаимодействии с рецепторами активации uNK-клеток (KIR2DS1 или KIR2DS4), индуцируют секрецию гранулоцитарно-макрофагального и колониестимулирующего факторов (GM-CSF), которые способствуют инвазии клеток трофобласта [8].

В литературе встречаются единичные работы с количественной оценкой содержания NK-клеток в крови беременных с ПАИП [12], а исследований, описывающих функциональную активность pNK-клеток при приращении плаценты, нами не найдено. Некоторые исследования указывают на слабую экспрессию uNK-клеток в децидуальной оболочке биоптатов плацентарного ложа у женщин с ПАИП по сравнению с беременными без патологии плацентации [13, 27]. Другими авторами показано не только снижение экспрессии uNK-клеток в плацентарном ложе при ПАИП, но и прямая положительная корреляция с факторами риска аномальной инвазии и  антиангиогенными факторами по сравнению с женщинами контрольной группы [12].

В проведенном нами исследовании выявлено, что цитотоксическая активность pNK-клеток в отношении клеток трофобласта линии JEG-3 выше у женщин с физиологической беременностью без рубца на матке, чем у женщин с кесаревым сечением в анамнезе, но различий в сравнении с основной группой не получено. Более низкая цитотоксическая активность NK-клеток у женщин, перенесших кесарево сечение в анамнезе, по сравнению с интактным миометрием, вероятно, ассоциирована с особенностями цитотоксической активности NK-клеток на границе мать-плацента-плод в области рубца на матке без признаков аномальной инвазии трофобласта. В более ранних исследованиях Skret-Magierlo J. et al. показано, что у пациенток при повторном кесаревом сечении с нормальной  плацентацией наблюдается более высокая экспрессия CD56⁺ клеток в рубцовой ткани, по сравнению с децидуальной оболочкой пациенток, перенесших плановое кесарево сечение впервые, но функциональная активность клеток в данном исследовании не оценена [28].

При взаимодействии HLA-G клеток трофобласта и рецептора KIR2DL4 запускается синтез проангиогенных и провоспалительных факторов. Посредством данного взаимодействия индуцируется продукция NK-клеток, которые обладают низкой цитотоксичностью, но активно продуцируют провоспалительные цитокины, ангиогенные факторы, такие как VEGF и ангиопоэтины [29]. Также в результате данного взаимодействия NK-клетки синтезируют протеолитические факторы, такие как металлопротеиназы, которые стимулируют инвазию трофобласта и трансформацию спиральных артерий [30]. Таким образом, можно предположить, что у пациенток с ПАИП при сопоставимой с группами беременных без приращения плаценты цитотоксической активности NK-клеток изменяется продукция проангиогенных факторов и протеолитических ферментов, которые, по мнению ряда авторов, патогенетически обуславливают приращение плаценты [30, 31].

Результаты настоящего исследования согласуются с данными литературы о том, что увеличение частоты беременностей, выскабливаний полости матки и кесарева сечения в анамнезе ассоциировано с риском приращения плаценты в последующие беременности [32]. По мнению некоторых авторов, снижение dNK-клеток первично обусловлено повреждением миометрия в результате предыдущих операций кесарева сечения [33]. В других исследованиях показано, что при ПАИП периваскулярная инфильтрация иммунных клеток, в том числе uNK-клеток, характерна не только для ремоделированных сосудов в области маточно-плацентарного контакта, но и для сосудов миометрия, не контактирующего с трофобластом, что говорит о паракринных механизмах инвазии трофобласта [11]. Важно отметить, что uNK-клетки обуславливают первоначальные структурные изменения маточно-плацентарных сосудов, которые начинаются до инвазии трофобласта, что может свидетельствовать о дисфункции NK-клеток в патогенезе ПАИП [34].

Заключение

В настоящем исследовании впервые проанализирована цитотоксическая активность pNK-клеток у женщин с наличием рубца на матке и ПАИП в сравнении с беременными с рубцом на матке, но без приращения плаценты и физиологической беременностью без рубца на матке. Более низкая цитотоксическая активность pNK-клеток у женщин с рубцом на матке без признаков аномальной инвазии трофобласта по сравнению с физиологической беременностью  позволяет предположить, что в патогенезе приращения плаценты значимую роль играет дисфункция NK-клеток.

Повреждение матки вследствие предыдущих операций кесарева сечения инициирует морфологические и функциональные изменения в децидуальной оболочке матки. Вероятно, сравнительно низкая цитотоксическая активность pNK-клеток в группе с рубцом на матке без аномальной инвазии плаценты ассоциирована с наличием механизма, препятствующего приращению плаценты в зоне рубца. Таким образом, интерес представляет выявление женщин из групп риска ПАИП с изменением цитотоксической активности NK-клеток для прогнозирования приращения плаценты на более ранних сроках беременности.