Прогнозирование неонатальных осложнений на основании количественного протеомного анализа крови беременных с задержкой роста плода

Современное определение задержки роста плода включает отставание скорости роста плода, которое приводит к снижению массы и длины тела при рождении менее 10-центиля [1, 2]. Основной причиной развития задержки роста плода является плацентарная недостаточность, проявляющаяся неадекватным поступлением кислорода и питательных веществ к плоду и реализующаяся клинически в виде хронической гипоксии плода и гипогликемии. На фоне хронической гипоксии происходит адаптация сердечно-сосудистой системы плода, которая диагностируется по данным допплерометрии как усиление сердечного выброса и кровотока в головном мозге, надпочечниках. Это приводит к тому, что дети с задержкой роста плода имеют высокую частоту неонатальной заболеваемости [3–7]. По данным Kim F. et al., Misan N. et al. у новорожденных с задержкой роста плода, родившихся в сроке более 32 недель, более часто выявляются внутрижелудочковые кровоизлияния, что повышает риск развития церебрального паралича [8, 9]. Несмотря на то, что в последнее десятилетие увеличилось число исследований, посвященных патогенезу замедления роста плода, а также биомаркеров, способных идентифицировать задержку роста плода на ранней стадии, возможность прогнозирования и стратификации тяжести как анте- так и постнатальных осложнений у новорожденных при данных патологиях, по-прежнему отсутствует. В этих условиях протеомные исследования, учитывая их простоту и точность, могут стать перспективным направлением в прогнозировании неонатальных у детей.

Цель исследования: определить взаимосвязь ранних неонатальных осложнений с особенностями протеомного состава крови беременных при задержке роста плода.

Материалы и методы

Было проведено пилотное исследование «случай-контроль», в которое вошли 40 пар «беременная женщина–новорожденный ребенок», родоразрешенных в ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России с 2019 по 2021 гг. Для реализации поставленной цели исследования было сформировано IV группы: I и II – основные группы, III и IV – группы сравнения. I группа – ранняя форма задержки роста плода (<32 недель) (n=10 пар), II группа – поздняя форма задержки роста плода (≥32 недель) (n=10 пар), III и IV группа – беременные родоразрешенные до и после 32 недель (n=10 пар/n=10 пар). Был проведен индивидуальный подбор пары образцов плазмы крови беременных «группа задержка роста плода/группа сравнения» согласно критерию «срок беременности на момент родоразрешения». В группу с задержкой роста плода были включены беременные женщины в возрасте от 18 до 45 лет, без тяжелой соматической и гинекологической патологии, с одноплодной беременностью и установленным антенатально диагнозом «задержка роста плода» (согласно диагностическим УЗ- и допплерометрическим критериям Delphi, критериям Клинических Рекомендаций Минздрава России «Недостаточный рост плода»), подписавшие добровольное информированное согласие на участие в исследование [10]. Для группы сравнения размеры плода соответствовали сроку беременности. Из исследования исключались беременные женшины с тяжелой экстрагенитальной патологией, многоплодной беременностью, хромосомной патологией и пороками развития плода. На проведение исследовательской работы было получено одобрение этического комитета.

Постнатально проведена оценка массо-ростовых показателей у новорожденных (n=40) согласно центильным кривым INTERGROWTH-21 и критериям, принятым на международном консенсусе неонатологов, для подтверждения антенатального диагноза задержки роста плода, а также нормального веса в группах сравнения (до 32 и после 32 недель) [11, 12]. Проводилась комплексная оценка состояния здоровья новорожденных на этапе госпитализации в неонатальные отделения. Количественный анализ 125 белков плазмы крови беременных женщин проводили с использованием набора BAK 125 (MRM Proteomics Inc, Монреаль, Канада) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) в режиме мониторинга множественных реакций (ММР). МС/МС-анализ выполнен на масс-спектрометре QTRAP SCIEX6500+ (SCIEX, Канада).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием программ Statistica 12.6, IBM SPSS Statistics 21 и пользовательских скриптов, разработанных на языке R 4.2.1. Были использованы дополнительные библиотеки плагинов ropls, e1071 и pROC. Оценка нормального распределения количественных показателей проводилась с помощью теста Шапиро–Уилка. При нормальном распределении описание проводилось с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95% доверительного интервала (95% ДИ). При распределении отличном от нормального использовалась медианы (Me) с определением нижнего и верхнего квартилей [Q1; Q3]. Категориальные данные описывались с указанием абсолютных значений и процентных долей. Сравнение между тремя или более группами при нормальном распределении количественных переменных проводилось с использованием дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим проведением post-hoc -анализа с использованием теста Тьюки (в случае равных дисперсий) или теста Геймса–Хауэлла (неравные дисперсии). Для сравнения двух групп, при распределении количественных переменных отличном от нормального, применялся U-критерий Манна–Уитни. Критерий Крускала–Уоллиса использовался для сравнений между трех или более групп, с последующим проведением сравнения post-hoc-анализа с тестом Данна, включающим поправку Холма. Сравнение процентных долей при анализе многопольных таблиц сопряженности выполнялось с помощью критерия хи-квадрат Пирсона. Статистическая значимость была установлена на уровне р<0,05. Для решения задачи по прогнозированию развития внутрижелудочковых кровоизлияний и асфиксии у новорожденных в раннем неонатальном периоде были построены модели на основе машины опорных векторов, для которых было выполнено ранжирование переменных посредством рекурсивного удаления переменных [13]: из моделей поэтапно исключались переменные с минимальным по модулю весом и на каждом этапе производился скользящий контроль по отдельному объекту для вычисления точности модели. Оптимальной признавалась модель с минимальным числом переменных при максимально возможной точности. Для адекватной работы классифицирующей машины опорных векторов в качестве переменных отклика образцам с задержкой роста плода (ранним или поздним фенотипом) присваивалось значение -1, для образцов группы контроля (ранней или поздней) присваивалось значение 1. Прогностическая значимость построенных моделей характеризовалась чувствительностью (Se) и специфичностью (Sp).

Результаты

В раннее проведенном исследовании было показано наличие взаимосвязи между протеомом крови беременной и задержкой роста плода. Принимая во внимание высокую частоту осложнений раннего неонатального периода при задержке роста плода, особый интерес представляло изучение взаимосвязи изменения протеомного состава плазмы крови беременных с развитием ранних неонатальных осложнений для определения возможности их прогнозирования.

Состояние ребенка в раннем неонатальном периоде, а также его дальнейшая адаптация зависят от срока родоразрешения и тяжести состояния при рождении, в связи с чем были проанализированы данные показатели (табл. 1). Следует отметить, что у детей группы с задержкой роста плода отмечен более низкий вес при рождении и оценка по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах (I, II группы), чем в группе сравнения (р<0,001, р=0,01 и p=0,02 соответственно), что было обусловлено критериями включения в исследование. В I группе (ранняя форма задержки роста плода) чаще рождались дети с экстремально низкой массой тела чем во II (поздняя форма задержки роста плода) группе (р<0,05). Анализ показателей кислотно-основного состояния пуповиной крови при рождении не выявил достоверных различий между группами по уровню лактата и рН (р=0,07 и p=0,59 соответственно), однако в I и II группах уровень глюкозы был ниже, чем в группах сравнения (р=0,001). Более высокая частота осложнений в раннем неонатальном периоде была выявлена в группе с задержкой роста плода (внутрижелудочковые кровоизлияния, респираторный дистресс синдром, легочное кровотечение, ДВС-синдром и кровоизлияния в кожу (р=0,003)). Следует отметить, что ранняя неонатальная смертность отмечалась достоверно чаще в I группе (ранняя форма задержки роста плода). Клиническая характеристика новорожденных, вошедших в исследование, представлена в таблице 1.

Следует отметить, более высокую частоту асфиксии на фоне хронической гипоксии и внутрижелудочковые кровоизлияния у детей с задержкой роста плода в раннем неонатальном периоде. На основании проведенных раннее исследований были выявлены особенности протеома для ранней задержки роста плода (повышение уровней (р<0,05) адипонектина, α-2-макроглобулин, гельсолина, белка зоны беременности, белка S100-A9, сывороточного альбумина, снижение уровня (р<0,05) аполипопротеина В-100, антимикробного пептида кателицидина, компонента комплемента С7, активатор плазминогена тканевого типа) и поздней формой задержки роста плода (повышение уровней (р<0,05) аполипопротеина A-IV, биотинидазы, белка гамма-цепи фибриногена, гельсолина, глутатионпероксидазы-3, плазминогена и ретинол-связывающего белка-4, снижение уровня (р<0,05) катионнезависимого маннозо-6-фосфатного рецептора) [14–17]. При проведении корреляционного анализа были установлены корреляции (р<0,05) между вышеуказанными белками и клиническими характеристиками новорожденного: весом, оценкой новорожденного по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, кислотно-основным состоянием (рН пуповинной крови, уровень лактата, глюкозы), развитием внутрижелудочковых кровоизлияний, а также длительностью пребывания в стационаре (рис. 1).

Статистически значимые корреляции были установлены между изменениями протеомного состава плазмы крови и развитием внутрижелудочковых кровоизлияний, а также асфиксии при рождении, которые наиболее часто по данным литературы встречается у детей с задержкой роста плода [18].

Следует отметить важность антенатального прогнозирования развития тяжести гипоксии у плода, реализующейся асфиксией при рождении в группе с задержкой роста плода, которое напрямую связанно не только с обоснованием решения о досрочном родоразрешении, но и влияет на частоту ятрогенных преждевременных родов, неонатальную заболеваемость.

Принимая во внимание полученные результаты протеомного анализа плазмы крови матери с целью прогнозирования данных осложнений у новорожденного с задержкой роста в раннем неонатальном периоде нами были построены 2 модели с использованием метода логистической регрессии (рис. 2).

Была выявлена корреляционная связь между развитием внутрижелудочкового кровоизлияния и уровнями белков: α-субъединицы гемоглобина материнской плазмы, белка S100-A9, β-цепи фибриногена, сывороточной параоксоназы/лактоназы 3, α-1-кислого гликопротеина 1 и липополисахарид связывающего белка.

В модель «1» для определения риска внутрижелудочкового кровоизлияния у новорожденного включены: α-1-кислый гликопротеин 1 (ORM1), α-1-антихимотрипсин (SERPINA3), α-1-В-гликопротеин (A1BG), α-2-макроглобулин (A2M), антитромбин III (SERPINC1), аполипопротеин A-IV (APOA4), аполипопротеин С-II (APOC2), аполипопротеин С-IV (APOC4), карбоангидраза 1 (CA1), антигенподобный CD5 (CD5L), церулоплазмин (CP), кластерин (CLU), комплемент C3 (C3), компонент комплемента C9 (C9), комплемент фактор H (CFH), транскортин (SERPINA6), α-цепь фибриногена (FGA), β-цепь фибриногена (FGB), фибронектин (FN1), фибулин-1 (FBLN1), гепариновый кофактор 2 (SERPIND1), каллистатин (SERPINA4), кератин II типа цитоскелетный 2 эпидермальный (KRT2), белок зоны беременности (PZP), протромбин (F2), феротрансферрин (TF), витамин К-зависимый белок S (PROS), витамин К-зависимый белок Z (PROZ), витронектин (VTN) (табл. 2) и разработана модель прогнозирования развития внутрижелудочкового кровоизлияния (рис. 2).

где С_x –концентрация белка X.

Чувствительность и специфичность полученной модели составили 92% и 100%, соответственно (рис. 2).

В модель «2» для прогнозирования асфиксии  в раннем неонатальном периоде включены: α-1-антихимотрипсин (SERPINA3), аполипопротеин С –III (APOC3), аполипопротеин D (APOD), β-2-гликопротеин-1 (APOH), субъединица С субкомпонента комплемента С1q (C1QC), компонент комплемента C9 (C9), кининоген 1 (KNG1), ингибитор плазменной протеазы С1 (SERPING1), белок зоны беременности  (PZP), AMBP белок (AMBP), протромбин (F2), витронектин (VTN) (табл. 3), на основании которых была разработана модель (рис. 2).

где С_x –концентрация белка X.

Чувствительность полученной модели составила 67%, а специфичность 100% (рис. 2).

Обсуждение

Задержка роста плода является одной из ведущих причин перинатальной заболеваемости и смертности, а также способствует развитию хронических заболеваний в долгосрочной перспективе [19, 20]. Это связано в первую очередь с развитием перинатальной асфиксии, трудностями кардиопульмонального перехода после рождения, аспирацией меконием, а также формированием стойкой легочной гипертензии на фоне развития осложнений в раннем неонатальном периоде таких как гипотермия, гипогликемия, полицитемия, желтуха, некротизирующий энтероколит и сепсис [21]. В исследованиях Boghossian N.S. et al. и Malhotra A. et al. сообщалось также о более высоких показателях некротизирующего энтероколита, ретинопатии недоношенных, сепсиса и внутрижелудочковых кровоизлияний в группе детей с задержкой роста [22, 23]. Высокий риск перинатальной асфиксии по мнению Hundscheid T.M. et al. можно объяснить плацентарной дисфункцией (недостаточностью), приводящей к прогрессированию хронической гипоксии плода, которая в ряде случаев сочетается с особенностями строения пуповины (оболочечное прикрепление пуповины) и течением беременности на фоне угрозы прерывания беременности (ретроплацентарные гематомы, отслойки плаценты) [24]. Принимая во внимание высокий риск повреждения тканей головного мозга у детей с задержкой роста плода на первое место в современной перинатальной медицине выходит своевременное антенатальное прогнозирования тяжелой асфиксии при рождении. Фактором риска перинатального повреждения головного мозга при задержке роста плода также является формирование внутрижелудочковых кровоизлияний. Была выявлена связь «плацентарной недостаточности – хронической гипоксии плода» с патологическим кровотоком в артерии пуповины при задержке роста плода. По данным Marsoosi V. et al. нулевой или обратный конечный диастолический кровоток в артерии пуповины и нулевой или отрицательный кровоток «А» в венозном протоке являются предикторами формирования внутрижелудочковых кровоизлияний и возможной смерти в раннем неонатальном периоде у новорожденных данной группы [2, 18]. По данным Miller S.L. et al., сохранение функционального состояния головного мозга является характерной реакцией на плацентарную недостаточность и хроническую гипоксию, а изменения притока крови к головному мозгу может указывать как на клиническую тяжесть течения задержки роста плода, так и ассоциироваться с нарушениями развития нервной системы у последнего [25, 26]. Адекватное, правильное прогнозирование развития внутрижелудочковых кровоизлияний и тяжелой асфиксии при рождении позволит выделить не только группы риска по реализации данной патологии у детей с задержкой роста плода, но также принять обоснованное решение о досрочном родоразрешении, что имеет прямую связь со снижением частоты преждевременных ятрогенных родов и процента неонатальной заболеваемости, связанной с проблемой недоношенности.

Среди выявленных в нашей работе дифференциально экспрессируемых белков при задержке роста плода особый интерес представляют белки, участвующие в процессах гемостаза (в том числе процессе дегрануляции тромбоцитов), а также в процессах регуляции иммунной системы. При задержке роста плода нет четких маркеров, позволяющих прогнозировать развитие внутрижелудочковых кровоизлияний как анте-, так и постнатально. Известно, что активация комплемента тесно связана с повышенной активностью тромбоцитов (внешний путь гемостаза). Гемостаз при задержке роста плода имеет ряд патологических особенностей, связанных с системой фибринолиза, что влияет на маточно-плацентарный кровоток. Полученные результаты согласуются с данными Гусар В. и соавт., которые показали взаимосвязь между экспрессией микроРНК (miR-125b-5p), участвующей в сигнальных путях, связанных с ангиогенезом, реакцией на гипоксию через активацию сигнального пути HIF-1, дифференцировкой/жизнедеятельностью нейронов и генов, ассоциированных с окислительным стрессом в плазме пуповинной крови, с гемодинамическими изменениями в системе мать-плацента-плод, что имеет прямую корреляцию с развитием внутрижелудочковых кровоизлияний [27]. В настоящем исследовании показано, что несмотря на высокий уровень активации тромбоцитов при раннем фенотипе задержки роста плода, происходит снижение скорости фибринолиза и регуляции активности тканевого активатора плазминогена в плазме крови. Этот дисбаланс в системе фибринолиза может привести к повышенному образованию тромбов при ранней форме задержки роста плода. Нелизированные сгустки могут повредить сосудистую стенку, что приводит не только к ишемии или отслойке плаценты, но и потенциально к развитию внутрижелудочковых кровоизлияний как анте- так и постнатально.

Модель «1», полученная в ходе проведения работы, к сожалению, пока не позволяет диффренецировать внутрижелудочковое кровоизлияние, произошедшее анте- или постнатально, но позволит в дальнейшем выделить группы риска по развитию данного осложнения при задержке роста плода.

Отдельный интерес представляют данные о корреляции протеома с развитием асфиксии при рождении у плодов с задержкой роста для выделения группы риска. Известно, что основной причиной задержки роста плода является плацентарная недостаточность, в результате которой развивается хроническая гипоксия плода, приводящая к снижению темпов роста плода, перераспределению кровоснабжения головного мозга (уменьшение общего объема головного мозга и его структуры) [18]. Патологические значения индексов сопротивления в маточно-плацентарном кровотоке, приводящие к ухудшению сердечно-сосудистой системы, недоношенность в результате ятрогении и внутричерепные кровоизлияния повышают риск задержки психомоторного развития и церебрального паралича. В свою очередь изменения кровообращения является одним из факторов, регулирующих созревание нейронов, иммунные и эндокринные взаимодействия плаценты и плода [28]. В ходе работы была выявлена корреляция аполипопротеин A-IV почти со всеми клиническими параметрами у новорожденных основной группы (весом и баллами по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах, тяжестью асфиксии при рождении, показателям КОС при рождении (рН пуповинной крови, уровнем лактата, глюкозы), развития внутрижелудочкового кровоизлияния, длительность пребывания ребенка в стационаре и продолжительность жизни новорожденного). В случае позднего начала задержки роста плода вторичная плацентарная недостаточность часто приводит к более высокой толерантности плода к гипоксии и более благоприятным исходам, включая более низкую частоту перинатальной заболеваемости и смертности. Полученные нами выводы согласуются с результатами исследования Malhotra A. et al., которые также отметили большой практический и научный интерес к стратегии антенатального выявления патологии нервной системы у детей с задержкой роста плода [18]. Использование протеомного профиля, полученного в ходе проведения исследования (модель «1» и «2»), как малоинвазивного метода, позволит в будущем прогнозировать и выделять группы риска по развитию не только внутрижелудочкового кровоизлияния, но и тяжелой асфиксии при рождении у новорожденных с задержкой роста плода, что также повысит эффективность оценки степени повреждения головного мозга, связанную с исходами поражения нервной системы у новорожденных данной группы [28].

Заключение

Таким образом, белки материнской плазмы крови могут быть предложены в качестве прогностических маркеров осложнений в раннем неонатальном периоде (асфиксии, внутрижелудочковые кровоизлияния, гипоксическое поражение центральной нервной системы) у новорожденных с диагностированной задержкой роста, что позволит улучшить качество оказания медицинской помощи с позиции современной перинатальной медицины.