Влияние фрагментации днк сперматозоидов на исходы беременности, наступившей самостоятельно и при применении программ вспомогательных репродуктивных технологий

Взаимосвязь между показателями ДНК фрагментации сперматозоидов и успешными исходами беременности широко изучают уже более двух десятилетий, а интерес к этому вопросу уходит корнями в прошлое столетие. В 1940-х гг. был обнаружен уникальный белковый компонент сперматозоидов, который стабилизирует ДНК. В 1950-х и 1960-х гг. установили связь между неустойчивой структурой хроматина и снижением фертильности, а в 1970-х гг. – влияние индуцированного повреждения ДНК. В 1980-х гг. была предложена концепция о том, что фрагментация ДНК сперматозоидов связана с бесплодием, а также разработан первый тест на фрагментацию ДНК: анализ структуры хроматина сперматозоидов (SCSA). Метод обнаружения фрагментации апоптотической ДНК – тест терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL) – стал применяться в 1990-е гг. [1, 2].

В научных исследованиях наибольшую прогностическую значимость с позиции успеха вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) продемонстрировали методы TUNEL и COMET («комета-тест», электрофорез нуклеотидов отдельных клеток в геле агарозы) [3]. В настоящее время наибольшее распространение получил метод TUNEL, так как именно он был использован в большей части исследований, посвященных изучению влияния фрагментации ДНК сперматозоидов на репродуктивные исходы и фертильность. Прямой метод TUNEL выявляет как одноцепочечные, так и двуцепочечные разрывы молекулы ДНК сперматозоидов, таким образом давая специалисту больше информации для оценки вероятности успеха того или иного метода ВРТ [4].

Причины фрагментации ДНК сперматозоидов не до конца изучены. Считается, что основной причиной является оксидативный стресс, а именно повышение уровня активных форм кислорода (АФК; Reactive oxygen species, ROS) в эякуляте. Избыточное количество активных радикалов кислорода способно разрушать плазматическую мембрану и генетический материал сперматозоидов. Основным источником АФК являются лейкоциты и клетки сперматогенеза. Другими внутренними факторами повышения фрагментации ДНК считают неадекватное созревание сперматозоидов (нарушение конденсации хроматина), нарушение дозревания сперматозоидов в придатках яичек и апоптоз (генетически запрограммированная гибель клеток). Важная роль апоптоза состоит в устранении дефектных клеток, у которых разрушается ДНК [5–7].

Кроме того, существуют и внешние факторы, которые в той или иной степени могут повышать процент фрагментации ДНК сперматозоидов:

• возраст (старше 40 лет);
• ожирение;
• вредные привычки;
• влияние высоких температур (злоупотребление банями/саунами);
• хронические/острые воспалительные заболевания мужской мочеполовой системы;
• воздействия ионизирующего излучения (лучевая и/или химиотерапия);
• варикоцеле (варикозное расширение вен семенного канатика и яичка).

Поиск в электронных медицинских базах с 2012 г. по 2024 г. выявляет повышение интереса к данной проблеме, так как было представлено более 2500 статей или работ, в отличие от 815 публикаций в период с 2002 г. по 2011 г. Учитывая повышенный интерес к этому вопросу, следует предположить необходимость детального изучения значимости применения тестирования фрагментации ДНК сперматозоидов в клинической практике.

Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на наступление беременности

Супружеским парам, которым не удалось достичь наступления самостоятельной беременности в течение 1 года регулярной половой жизни без контрацепции, правомочно поставить диагноз бесплодие. На сегодняшний день мужской фактор является причиной субфертильности в 50% случаев [8, 9].   Оценка показателей спермограммы является основным методом диагностики. Однако, расшифровка спермограммы, выполненной согласно рекомендациям ВОЗ, не может помочь в анализе различных молекулярных и субклеточных факторов, связанных с мужским бесплодием [10]. Ведь общепринятый анализ может иметь нормальные показатели при наличии высоких параметров повреждения ДНК сперматозоидов. Убедительные результаты исследований свидетельствуют, что фрагментация  ДНК   сперматозоидов связана с мужским фактором бесплодия, и, как следствие, приводит к трудностям естественного зачатия, неудовлетворительным исходам ВРТ, увеличению частоты ранних репродуктивных потерь [9].

Сперматозоиды и яйцеклетка вносят равный вклад в геном эмбриона; следовательно, любой из них может привести к фатальным дефектам на стадии эмбрионального развития. Целостность ДНК сперматозоидов является важной детерминантой нормальной фертилизации и развития эмбрионов. В мужских гаметах с поврежденной ДНК снижена оплодотворяющая способность; вместе с тем, если оплодотворение произошло, в дальнейшем в эмбриональном развитии плода могут происходить нарушения, часто приводящие к прерыванию беременности. Иногда повреждения ДНК столь значительны, что эмбрион погибает на ранних этапах развития, при которых не удается даже выявить биохимические маркеры беременности. При повышении уровня фрагментации ДНК сперматозоидов снижается частота наступления беременности, увеличивается вероятность спонтанного аборта, а также снижается вероятность успеха ЭКО [11–13].

В большинстве цитируемых ниже работ подтверждается, что повреждение ДНК оказывает сильное влияние на снижение оплодотворения, качество эмбрионов, уменьшение количества эмбрионов, достигающих стадии бластоцисты, увеличение процента эмбрионов, у которых происходит остановка в развитии, снижение частоты имплантации и беременности. Во многих исследованиях была установлена корреляция между индексом фрагментации ДНК и исходом беременности. При уровне фрагментации 20–30% снижается вероятность наступления беременности. Было установлено, что индекс фрагментации ДНК более 30% имеет решающее значение для зачатия. При изучении  влияния  нарушения структуры ДНК сперматозоидов была определена  отрицательная  корреляция между уровнями фрагментации ДНК и подвижностью сперматозоидов у фертильных пар [14].

Влияние фрагментации ДНК сперматозоидов на исходы проведения внутриматочной инсеминации

В ряде исследований определена взаимосвязь между параметрами фрагментации ДНК и результатами проведения внутриматочной инсеминации (ВМИ). Среди 154 пар после данной процедуры у 119 пациенток беременность не наступила в том случае, когда индекс фрагментации ДНК  был более 12% [11]. В другом исследовании при проведении ВМИ с параметрами нарушения целостности ДНК спермы более 30%, наблюдались самопроизвольные аборты в 13% случаев из 100 супружеских пар. На основании этих данных, для достижения положительного исхода перед проведением процедуры ВМИ рекомендовано прохождение тестирования  фрагментации ДНК сперматозоидов [15].

Влияние фрагментации ДНК на исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий

Воздействие высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов на исход ВРТ остается неопределенным. Сперматозоиды с поврежденной  ДНК способны к оплодотворению, и данный факт объясняет положительный исход при процедуре ЭКО и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), даже при высоких показателях фрагментации ДНК спермы [16].

ИКСИ признана достаточно эффективным методом лечения мужского бесплодия у пациентов, у которых наблюдается плохое качество спермы и/или неудачные исходы программы с оплодотворением методом ЭКО. Выбор сперматозоида для ИКСИ основывается на решении эмбриолога, который выбирает подвижный сперматозоид с максимально хорошим морфологическим внешним видом. Данные о роли ИКСИ в сравнении с ЭКО у мужчин с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов также противоречивы. Ведь выбранные сперматозоиды могут иметь поврежденную ДНК, и соответственно, целостность ДНК выбранной мужской гаметы может являться основным фактором, определяющим успех проведения программы ВРТ.  

В литературе представлены результаты проведения программы ЭКО/ИКСИ с использованием морфологически нормальных сперматозоидов, но имеющих повышенный уровень фрагментации ДНК. Наблюдалась корреляция повреждения структуры ДНК с качеством полученных эмбрионов, и, как следствие, с исходом беременности. Исследование показало, что значения фрагментации ДНК сперматозоидов являются статистически значимыми предикторами беременности. При фрагментации ДНК <17,6% вероятность наступления беременности была в 3,5 раза выше. Вместе с тем, не было обнаружено корреляции между процентом общего количества сперматозоидов с фрагментированной ДНК и результатами проведения ИКСИ. Суммируя вышеизложенное, можно заключить, что фрагментация ДНК в морфологически нормальных сперматозоидах отрицательно влияет на качество эмбрионов и вероятность наступления беременности в циклах ИКСИ [17, 18].

Также неоднозначные результаты получены при исследовании влияния повреждения ДНК сперматозоидов на частоту наступления беременности при применении ИКСИ. В первых исследованиях было показано значительное снижение количества беременностей после ИКСИ [19, 20]. Было установлено, что беременность при применении процедуры ИКСИ наступала, если показатель фрагментации ДНК сперматозоидов был низким, и не наступала при показателях более 20% [21]. Наблюдалась корреляция при повреждении ДНК сперматозоидов с уровнем рождаемости после процедуры ЭКО. Есть данные про обследование 203 пар, прошедших процедуру ЭКО, и 136 пар после применения ИКСИ. После процедуры ЭКО рождаемость у пар с показателем фрагментации ДНК <25% составляла 33%, а у пар с показателем фрагментации ДНК >50% – 13% соответственно. После процедуры ИКСИ не было выявлено существенных различий в повреждении ДНК спермы. Нарушение структуры ДНК эякулята также ассоциировалось с низким уровнем рождаемости после процедуры ЭКО и у пар с идиопатическим бесплодием: 39% пар при выполнении ЭКО и 41% мужчин с  идиопатическим бесплодием имели высокие параметры фрагментации ДНК сперматозоидов [22].

Противоречивые результаты влияния показателей фрагментации ДНК сперматозоидов у мужчин продемонстрированы в трех метаанализах. В одном из них у супружеских пар  беременность наступала в 2 раза чаще после ЭКО и в 1,6 раза – после ИКСИ, если показатель фрагментации ДНК сперматозоидов был снижен [16]. Еще в одном метаанализе показана корреляция между наступлением беременности в циклах ЭКО и ИКСИ, и повреждением структуры ДНК сперматозоидов [22]. В третьем исследовании показатели наступления беременности также были ниже после ЭКО, но не после ИКСИ, у пациентов с высокими параметрами фрагментации ДНК сперматозоидов [23].

Существует мнение, что применение такого метода оплодотворения как ИКСИ, предпочтительнее ЭКО у супружеских пар с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов. Высказано предположение, что улучшение результатов после ИКСИ возможно, по крайней мере, частично, объяснить стандартным процессом отбора морфологически нормальных подвижных сперматозоидов. Этот процесс отбора может привести к использованию сперматозоидов с меньшей фрагментацией ДНК. И приведенные обзоры показали, что применение ИКСИ может повысить частоту наступления клинической беременности у супружеских пар с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов.

В исследовании [24] были определены группы супружеских пар в зависимости от показателей фрагментации ДНК сперматозоидов менее и более 30% соответственно, и пары были стратифицированы по группам с учетом метода оплодотворения. Не было обнаружено статистической значимости между результатами проведения ИКСИ и ЭКО в группе с параметрами фрагментации ДНК менее 30%. Вместе с тем, в группе пациентов с индексом фрагментации ДНК более 30% результаты ИКСИ были успешнее, нежели при проведении ЭКО. Частота имплантации в группе ИКСИ с индексом фрагментации ДНК более 30% также была выше [24].

Рассматривая метаанализ, который был направлен на определение взаимосвязи между степенью фрагментации ДНК сперматозоидов и живорождением, авторы стремились оценить влияние ЭКО/ИКСИ у супружеских пар с высокой и низкой фрагментацией ДНК сперматозоидов на благоприятные исходы беременности.  Значительно более высокий коэффициент живорождения наблюдался после ЭКО у мужчин с низкой фрагментацией ДНК сперматозоидов, по сравнению с мужчинами с высокими индексами фрагментации ДНК. В целом, значительное увеличение процента живорождения наблюдалось у пар с низкой фрагментацией ДНК сперматозоидов, по сравнению с парами с высокой фрагментацией ДНК в случае, когда были объединены результаты исследований, в которых применялось ЭКО и ИКСИ. Затем были проанализированы исследования, в которых использовалось ЭКО, и те, в которых было применено ИКСИ отдельно, чтобы установить влияние метода оплодотворения на результат лечения. Показано, что высокая фрагментация ДНК сперматозоидов связана с худшим результатом при использовании метода ЭКО. Данная ассоциация не наблюдалась при применении ИКСИ. Из этого следует, что применение ИКСИ предпочтительнее ЭКО у мужчин с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов. 

При анализе результатов программ ВРТ, вопрос, почему исходы в группах лечения ЭКО были менее перспективными, чем в циклах ИКСИ, остается открытым. Возможно, это произошло вследствие того, что в группах с применением ИКСИ процент здоровых женщин был выше. Это, в свою очередь, свидетельствует о высоких шансах получения пригодного качества эмбрионов  при применении ооцитов надлежащего качества [25].

Сравнительно недавно была изучена взаимосвязь между параметрами ДНК эякулята и частотой развития самопроизвольного выкидыша [7]. Это оказалось полезным направлением исследования, поскольку целостность ДНК сперматозоидов имеет решающее значение для точной передачи генетической информации отца эмбриону. 

Самопроизвольное прерывание беременности затрагивает 10–15% пар; при этом 1–2% пациентов страдают привычным невынашиванием, а 50% выкидышей остаются необъяснимыми [26]. Целостность мужского генома играет не последнюю роль для здорового потомства, а это означает, что качество ДНК спермы может иметь важное значение для сохранения беременности. Результаты одного клинического исследования, в котором наблюдалось изучение влияния показателей фрагментации ДНК сперматозоидов на частоту ранних репродуктивных потерь в естественном зачатии продемонстрировали, что у супружеских пар, перенесших самопроизвольный выкидыш, наблюдались высокие параметры нарушения структуры ДНК сперматозоидов [27]. Также установлено, что в 30% случаев привычные выкидыши встречались при показателях выше 15% [11].

Для дальнейшего изучения влияния фрагментации ДНК сперматозоидов на частоту развития репродуктивных потерь после проведения программ ВРТ были проанализированы данные систематического обзора, в котором авторы оценивали корреляцию между показателями фрагментации ДНК и частотой развития самопроизвольных абортов в программах ЭКО/ИКСИ. Для детального изучения были выбраны супружеские пары с неразвивающейся клинической беременностью. Клинически значимый порог ДНК фрагментации был выбран путем изучения предшествующих исследований и определения медианного значения в популяции. Анализ исследований, в который было включено 1549 циклов ВРТ (808 – проведение ЭКО, 741 – проведение ИКСИ), указывает на то, что нарушение структуры ДНК сперматозоидов может являться важным предиктором потери беременности после проведения ЭКО/ИКСИ. Соответственно,  полученные данные представляют веский повод и обоснование для дальнейшего изучения связи между повреждением ДНК сперматозоидов и развитием ранних репродуктивных потерь, а также определения клинических рекомендаций для оценки фрагментации ДНК сперматозоидов, с последующей формулировкой диагностически значимых показателей [18].

Еще один систематический обзор охватывает результаты 16 исследований, в 14 из которых аналогичным образом подтверждено влияние повреждения ДНК сперматозоидов на наступление беременности и частоту развития ранних репродуктивных потерь. Чем выше показатели ДНК фрагментации, тем ниже шанс наступления беременности и, как следствие, повышен риск развития самопроизвольных выкидышей [28]. Высокие показатели самопроизвольных абортов, зарегистрированные при применении как ЭКО, так и ИКСИ, у мужчин с высокой фрагментацией ДНК сперматозоидов, позволяют предположить, что пагубный эффект сохраняется одинаково при обоих методах оплодотворения.

Вышеизложенные систематические обзоры и метаанализы указывают, что повреждение структуры ДНК сперматозоидов значительно коррелирует с повышенным риском  выкидыша после естественного зачатия, а также после ЭКО и ИКСИ [18].

В заключение следует отметить, что повреждение ДНК сперматозоидов связано со значительно повышенным риском развития репродуктивных неудач после ЭКО и ИКСИ. Эти данные являются клиническими показаниями для оценки ДНК сперматозоидов [29].

Сперматозоиды с поврежденным хроматином могут сохранять свою способность к оплодотворению. Неоднозначные результаты, полученные в исследованиях, где оценивали корреляцию индекса фрагментации ДНК и способности к оплодотворению, могут быть объяснены, по крайней мере частично, разнообразным характером повреждения ДНК и способностью яйцеклетки к репарации. Существует мнение, что ферменты яйцеклетки после оплодотворения могут корректировать до 10% повреждений ДНК сперматозоидов, но это будет зависеть от степени повреждения цепочки ДНК и качества яйцеклетки. Остальные «неисправленные» разрывы ДНК ведут к нарушению генома эмбриона и остановке развития беременности на ранних сроках, в том числе на ранних этапах эмбриогенеза, особенно при применении метода ЭКО. Действительно, влияние индекса фрагментации ДНК сперматозоидов на репродуктивный успех будет зависеть от баланса между степенью повреждения ДНК, качеством ооцита и его способностью к репарации генома [30]. Сперматозоиды не способны к восстановлению ДНК, тогда как ооцит имеет некие репаративные возможности в периоде постфертилизации. Репарация ДНК может происходить во время и после оплодотворения в ооците и развивающейся зиготе. Точный механизм, с помощью которого ооцит восстанавливает повреждения ДНК сперматозоидов, остается неизвестным.

 Отрицательное влияние высокого индекса фрагментации ДНК сперматозоидов на беременность может быть преодолено путем применения ооцитов высокого качества, как отображено в исследовании со сравнением стандартного и донорского циклов [16]. В метаанализе, который также был направлен на изучение влияния целостности ДНК сперматозоидов на процессы раннего эмбриогенеза, в случаях, когда применены ооциты донора, основным выводом является то, что нарушение структуры ДНК сперматозоидов действительно оказывает влияние на исходы ВРТ. Молодой возраст женщины может влиять на способности ооцита восстанавливать частично поврежденные участки ДНК сперматозоидов, но данное свойство может быть сниженным в клетках женщин старшего репродуктивного возраста. В ситуациях, когда были оплодотворены ооциты субфертильных женщин старшего репродуктивного возраста, это оказывало серьезное влияние на развитие эмбрионов, и, таким образом, маскировало последствия повреждения ДНК сперматозоидов [31].

Заключение

В связи с увеличением роли мужского фактора бесплодия очень важно обращать внимание на дополнительные методы обследования, помимо общепринятых. Нарушение целостности структуры ДНК эякулята оказывает значительное влияние как на наступление самостоятельной беременности, так и на исходы программ ВРТ. Для достижения эффективных исходов циклов ЭКО, снижения риска развития ранних репродуктивных потерь необходимо внедрить тестирование фрагментации ДНК сперматозоидов в рутинную практику для конкретных групп супружеских пар, с последующим определением клинически значимых показателей для стратификации пациентов на соответствующие группы, согласно параметрам фрагментации ДНК гамет.

Повреждение ДНК сперматозоидов может стать надежным биомаркером спорадических и привычных выкидышей после самопроизвольного или вспомогательного зачатия, а также обеспечить новые рекомендации для будущих путей восстановления фертильности.

Проанализированная выше информация о фрагментации ДНК открывает большую перспективу в рамках исследования, в котором будут оценены многочисленные аспекты целостности ДНК сперматозоидов, что в свою очередь может помочь подтвердить выводы и выявить корреляцию между нарушениями структуры ДНК эякулята, частотой наступления беременности, а также частотой ранних репродуктивных потерь.