Эпидемиология и Инфекционные болезни. Актуальные вопросы №6 / 2015
Актуальные аспекты изучения Candidatus Rickettsia tarasevichiae
1Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора; 2Омский государственный медицинский университет Минздрава России
Цель исследования. Анализ данных изучения кандидата в новые виды – Candidatus Rickettsia tarasevichiae.
Материалы и методы. В работе были использованы 382 экземпляра клещей Ixodes persulcatus, 4 штамма Candidatus R. tarasevichiae, 276 сывороток крови пациентов. Изоляцию риккетсий проводили на культуре клеток Vero с использованием технологии shell vial. Экспериментальная инфекция воспроизведена на самцах морских свинок. Идентификацию риккетсий проводили в ПЦР с последующим секвенированием. Выявление антител классов IgM и IgG к Candidatus R. tarasevichiae в сыворотках крови пациентов проводили с использованием иммуноферментного анализа.
Результаты. Определена инфицированность клещей I. persulcatus этим микроорганизмом на территории России. Впервые при исследовании снятых с людей переносчиков в Омской области выявлены фрагменты гена ompA Candidatus R. tarasevichiae. Впервые изучены особенности культивирования штаммов Candidatus R. tarasevichiae. Этот вид риккетсий вызывает нелетальную экспериментальную инфекцию с преимущественным поражением сосудов головного мозга.
Заключение. В ареале клещей I. persulcatus – основного хозяина Candidatus R. tarasevichiae – часть лихорадок неустановленной этиологии после присасывания клещей может быть вызвана данным видом риккетсий, что необходимо учитывать при дифференциальной диагностике.
В последние годы отмечается увеличение числа новых генотипов риккетсий, что связано с совершенствованием методов их идентификации.
При исследовании клещей I. persulcatus, собранных в Тюкалинском районе Омской области, с помощью гемоцитового теста [1] и метода флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими люминесцирующими для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) и риккетсий группы сыпного тифа выявлено, что 23 ± 4,2% из них содержали риккетсии [2]. При дальнейших исследованиях с использованием методов молекулярно-биологического анализа в клещах I. persulcatus, собранных в России, описан новый генотип риккетсий – Candidatus Rickettsia tarasevichiae, названный в честь академика Ирины Владимировны Тарасевич [3].
Цель исследования – анализ имеющихся к настоящему времени данных изучения кандидата в новые виды Candidatus Rickettsia tarasevichiae.
Материалы и методы
В работе использован комплекс риккетсиологических, серологических, молекулярно-генетических методов.
Сбор иксодовых клещей проводили на стандартную волокушу. С помощью молекулярно-биологических методов (ПЦР-секвенирование) исследовано 317 экземпляров клещей I. persulcatus, собранных с растительности в Челябинской, Томской, Омской и Новосибирской областях, Алтайском, Красноярском и Приморском краях. Для выделения штаммов риккетсий в 2003 г. индивидуально исследовано 79 экземпляров клещей I. persulcatus из лесостепи Омской (Подгородка) и Новосибирской (Усть-Тарка) областей и горно-таежной зоны Красноярского края (заповедник «Столбы»).
Культивирование риккетсий проводили по методике, указанной ранее [4, 5]. Культуральные флаконы с инфицированными клетками культивировали в углекислотном термостате при температуре 37 оС в течение 8–16 суток. После завершения инкубации флаконы подвергали замораживанию в низкотемпературном холодильнике при -20 оС, а потом оттаиванию для разрушения клеток и максимального выхода из них риккетсий. После оттаивания материал центрифугировали в течение 10 мин. при 3000 об/мин. Супернатант в объеме 0,5 мл брали в следующий пассаж, а из 0,2 мл делали мазки; остатки супернатанта хранили в криопробирках в низкотемпературном холодильнике.
Полученные образцы исследовали методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используя иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПЛ, люминесцирующие сухие (НПО «Биомед», Россия). Изучение морфологических и тинкториальных свойств риккетсий проводили в соответствии с рекомендациями П.Ф. Здродовского и Е.М. Голиневич [6].
Однораундовую ПЦР проводили с применением праймеров, амплифицирующих фрагменты генов цитратсинтазы (gltA), 16S рибосомальной РНК и поверхностного мембранного белка 190 кДа (omp A) с последующим секвенированием положительных образцов ДНК [3].
Воспроизведение экспериментальной инфекции проводили в биопробах на морских свинках-самцах весом 300–350 г. путем внутрибрюшинного введения 2,0 мл 10–20% суспензии лиофилизированных штаммов, полученных на культурах клеток. В работе использованы штаммы «Усть-Тарка–10/2003», «Усть-Тарка–34/2003», «Подгородка-22/2003», «Подгородка-27/2003». Каждым штаммом было заражено по 3 морских свинки.
Результаты и обсуждение
Молекулярно-биологические исследования
Полученные последовательности нуклеотидов составили 1322 п.о. для гена 16S рибосомальной РНК и 1196 п.о. – для гена цитратсинтазы (gltA). При сравнении их с имеющимися в Genbank они показали свою уникальность и имели наибольший процент гомологии с Rickettsia canadensis: 98% соответствия по гену 16S рибосомальной РНК и 96% гомологии по гену gltA (номера Genbank AF 503168 и AF 503167 соответственно). Для гена gltA установлено 38 различий в нуклеотидах с Rickettsia canadensis, по гену 16S рибосомальной РНК – 19. По действующим критериям таксономии риккетсий [7], данный генотип не принадлежит к группам КПЛ и СТ и не может быть отнесен ни к одному из известных видов рода Rickettsia.
Определена высокая инфицированность клещей I. persulcatus этим микроорганизмом на ряде территорий России: в Челябинской, Томской, Омской и Новосибирской областях, Алтайском, Красноярском и Приморском краях. Этот риккетсиальный агент был обнаружен у 81 из 317 и...
