Анализ метаболитов в различных средах культивирования эмбрионов человека

Цель. Провести сравнительный метаболомный анализ состава отработанных питательных сред, в том числе содержащих гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), для выявления молекулярных профилей, позволяющих прогнозировать имплантационный потенциал эмбрионов человека.
Материалы и методы. В работе использовали образцы питательных сред эмбрионов, культивированных в присутствии и отсутствии ГМ-КСФ. Эмбрионы были получены от пациенток, проходящих программу экстракорпорального оплодотворения (ЭКО; ИКСИ). Детекцию метаболитов в отработанных питательных средах отдельных эмбрионов проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) в режиме детекции положительных ионов. После идентификации хроматографических пиков и выравнивания хроматограмм, а также для лучшей визуализации сравниваемых образцов по профилям метаболитов нами был проведен дискриминантный анализ методом частичных наименьших квадратов.
Результаты. Профилирование метаболитов позволило обнаружить существенные различия между отработанными питательными средами имплантировавшихся и неимплантировавшихся эмбрионов, вне зависимости от используемого вида культуральной среды. Были идентифицированы молекулярные ионы, содержание которых достоверно изменялось в средах имплантировавшихся эмбрионов. Сравнительный анализ потенциальных метаболитов в средах культивирования показал, что присутствие ГМ-КСФ может потенциально влиять на метаболизм жирных кислот в группе имплантировавшихся эмбрионов. Регуляция обмена жирных кислот, выполняющих структурные, питательные и сигнальные функции, играет важную роль в процессах раннего эмбрионального развития. Таким образом, присутствие в питательных средах ГМ-КСФ может способствовать адекватному формированию эмбриона и оказывать положительное влияние на его имплантационный потенциал.
Заключение. Анализ состава сред культивирования эмбрионов методом метаболомного профилирования может способствовать более точному отбору для селективного переноса одного эмбриона с целью снижения рисков, связанных с многоплодной беременностью.

Вскоре после первой успешной беременности с использованием экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) были разработаны различные системы классификации, основанные на морфологии эмбрионов и скорости их дробления. За последнее время удалось достичь значительных успехов в данной области, однако, несмотря на все достижения, частота наступления беременности с последующими родами остается все еще недостаточно высокой. Одной из ключевых проблем недостаточной эффективности вспомогательных репродуктивных технологий является отсутствие методов точной оценки репродуктивного потенциала отдельных эмбрионов, что ведет к низкой частоте имплантации.

Женщины с повторными неудачами имплантации составляют более 30% пациенток, проходящих лечение в программе ЭКО; при этом семейные пары часто подвергаются длительным, трудоемким схемам лечения, испытывая сложные психоэмоциональные и финансовые проблемы [1].

Как известно, преждевременные роды при многоплодной беременности являются одной из причин высокой перинатальной заболеваемости и смертности, показатели которых в 3–4 раза выше, чем при одноплодной беременности, и увеличиваются прямо пропорционально количеству плодов [2, 3]. Учитывая медицинские осложнения, связанные с многоплодной беременностью, некоторые страны ввели правовые ограничения на количество переносимых эмбрионов в циклах ЭКО.

Важной целью лечения бесплодия в современных условиях является уменьшение количества многоплодных беременностей и при этом сохранение или увеличение общего количества беременностей с помощью улучшения существующих методов оценки эмбрионов.

В настоящее время основным способом оценки качества получаемых эмбрионов является метод отбора по морфологическим критериям. Данный подход представляется простым и доступным, однако является недостаточным для прогнозирования последующей успешной имплантации [4].

В последнее десятилетие одним из современных и мощных инструментов улучшения эффективности циклов ЭКО является предимплантационное генетическое тестирование. Однако данный метод имеет ряд ограничений, основным из которых является потенциальное воздействие на эмбрион в момент проведения процедуры биопсии [5, 6]. Данные ограничения стимулировали исследователей на поиск различных вспомогательных неинвазивных методов оценки качества и жизнеспособности эмбрионов.

Метаболомика изучает уникальный состав низкомолекулярных химических соединений в клетках и биологических средах, формирующийся за счет многообразных метаболических процессов. В сравнении с транскриптомными и протеомными подходами, требующими в основном использования самого объекта исследования для анализа, метаболомное профилирование может дать ценную информацию о состоянии развивающегося эмбриона за счет анализа сред культивирования [7, 8]. Метаболизм эмбрионов человека можно изучать в основном по составу питательных сред, в которых происходит культивирование до момента переноса. Развитие инструментальных методов позволило проводить более комплексную оценку состава питательных сред с возможностью детектирования большого количества метаболитов.

Известно, что активность метаболизма меняется в зависимости от стадии развития, что является отражением морфофункционального состояния эмбриона. Также формирующийся метаболомный профиль на определенной стадии развития может использоваться в качестве информативной характеристики нормального или патологического фенотипа эмбриона [9], позволить оценить состояние и прогнозировать судьбу конкретного эмбриона [10]. Возможность применения данного подхода для оценки качества эмбриона и его имплантационного потенциала до сих пор остается малоизученной.

Для повышения эффективности культивирования эмбрионов в последние годы проводится разработка оптимальных питательных сред, наиболее подходящих для ранних этапов развития. В частности, одним из подходов является добавление в среду гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ, GM-CSF). Как было показано ранее, использование ГМ-КСФ способствует ускорению развития эмбриона, увеличению внутренней клеточной массы и снижению активности проапоптотических процессов [11–13]. Состав питательных сред от разных производителей в значительной степени варьирует: от сравнительно простых до многокомпонентных [14, 15]. Различия в составе, в свою очередь, могут отражаться на активности метаболических путей эмбриона и приводить к формированию специфических профилей метаболитов, соответствующих условиям культивирования. Важно отметить, что влияние состава среды на эмбриональный метаболом практически не изучалась.

Для выявления комбинаций метаболитов, которые потенциально могут служить маркерами успешной имплантации, а также облегчить выбор наиболее перспективного эмбриона, нами было проведено первичное исследование, целью которого явилось выявление отличий в профилях метаболитов эмбриональных питательных сред на 3-и и 5-е сутки культивирования в зависимости от вида питательной среды и исходов имплантации.

Материалы и методы

...

Ярыгина С.А., Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Эльдаров Ч.М., Гамисония А.М., Макарова Н.П., Бобров М.Ю.