Урология №4 / 2013

Деструктивные изменения в семенниках мыши при ретроградном пути их заражения вирусом простого герпеса

1 августа 2013

ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России (дир. – акад. РАМН Д. К. Львов); Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (дир. – проф. Н. Д. Озернюк)

Вирус простого герпеса (ВПГ) вызывает воспалительные заболевания органов мочеполовой системы мужчин, инфицирует мужские половые клетки, его присутствие в эякуляте ассоциируется с бесплодием. Однако сведений о путях проникновения ВПГ в яички, степени повреждения им сперматогенной ткани и влиянии на сперматогенез крайне мало. Целью настоящей работы было изучить действие ВПГ на сперматогенез мыши при ретроградном пути заражения вирусом. Использовали молекулярные (ПЦР в реальном времени), вирусологические, морфологические и иммуногистохимические методы. Анализ показал, что вирусный белок обнаруживается во всех слоях сперматогенного эпителия после введения вируса непосредственно в семенные канальцы. Доля канальцев, содержащих белок ВПГ, на 3-и сутки инфекции составляла 4,9%, достигала максимума на 6-е сутки – 23,5 и 18% для высокой и низкой доз ВПГ соответственно и далее снижалась; на 21-е и 45-е сутки вирусный белок не выявлялся. ДНК ВПГ обнаружена в семенниках на всех сроках инфекции. Начиная с 14-х суток после заражения масса семенников значительно снижалась по сравнению с контролем: к 45-м суткам – в 7,9 раза при высокой дозе ВПГ и в 4,9 – при низкой. Результатом действия ВПГ было развитие орхита и значительных деструктивных изменений в сперматогенной ткани. Доля морфологически нормальных канальцев снижалась до 6 и 15% на 14-е сутки и продолжала оставаться на низком уровне вплоть до 45-х суток. Приблизительно в половине семенных канальцев (46,5%) на 14-е и 21-е сутки отсутствовали соматические клетки Сертоли, необходимые для восстановления сперматогенной ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что при ретроградном пути заражения ВПГ мужских гонад происходят нарушения структуры семенника, гибель половых и соматических клеток, что указывает на необратимость дегенеративных изменений в инфицированных семенниках.

Введение. Установлено, что инфекционные заболевания мужских половых органов могут приводить к бесплодию [1]. В то же время данных о влиянии на мужскую фертильность вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1, -2), одного из самых распространенных вирусов в человеческой популяции, недостаточно.

ВПГ обнаружен в эякуляте человека, однако частота его выявления варьирует от 2,1 до 49,5% [2–4]. Неоднозначны также данные о влиянии ВПГ на качество спермы и фертильность [3–6]. Противоречия в результатах исследований, скорее всего, обусловлены различиями выборок пациентов и разной чувствительностью применяемых методов детекции вируса.

Показано, что ВПГ не способен проникать в сперматозоиды и инфицировать их [7], однако ДНК и белки ВПГ, а также вирусные капсиды обнаружены непосредственно в сперматозоидах человека [8, 9]. Это дает основание предполагать, что ВПГ заражает половые клетки на более ранних этапах дифференцировки. В инфицированных ВПГ эякулятах часто увеличено число дегенеративных незрелых половых клеток [10–12], что косвенно свидетельствует о нарушении нормального развития мужских половых клеток – сперматогенеза. В то же время о путях проникновения ВПГ в яички, степени нарушения сперматогенеза, развитии инфекционного процесса в мужских половых клетках известно крайне мало.

Целью настоящей работы было оценить влияние ВПГ на сперматогенез мыши после инокуляции ВПГ непосредственно в семенные канальцы, что имитирует один из вероятных путей проникновения вируса в яички у человека – ретроградный – через семявыносящие протоки к сети семенника rete testis и далее в семенные канальцы.

Материалы и методы. В работе использовали 2-месячных самцов мышей линии C57Bl/6. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

Инфицирование семенников мышей проводили ВПГ-1 (штамм F), полученным от проф. Л. Перейра (США). Пассирование и титрование ВПГ осуществляли на перевиваемой культуре клеток Vero. При разработке модели ретроградного введения ВПГ в семенные канальцы использовали методику введения жидкости в семенные канальцы через сеть семенника [13]. В каждый семенник вводили по 15 мкл вируссодержащей жидкости.

Животные были разделены на две группы. Мышам первой группы в каждый семенник инъецировали ВПГ с инфекционной множественностью 104 бляшкообразующих единиц (БОЕ) (высокая доза), мышам 2-й группы – 102 БОЕ (низкая доза). Мышам контрольной группы в семенники инъецировали культуральную среду в том же объеме. Отбор материала проводили на 3-и, 6, 10, 14, 21 и 45-е сутки после инфицирования ВПГ. В каждой группе на каждую экспериментальную точку отбирали материал от 3–5 животных.

Иммуногистохимический анализ. Для выявления белка ВПГ в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) готовили криосрезы семенников толщиной 4 мкм и окрашивали их первичными моноклональными антителами (МКА) к позднему белку ВПГ gB, а затем – соответствующими вторичными ФИТЦконъюгированными антителами («Dako», Дания). Срезы просматривали и фотографировали на микроскопе Leica DMRXA2 (США). На трех криосрезах семенников подсчитывали количество семенных канальцев, окрашенных МКА, и выражали в процентах от общего числа канальцев. Для проведения конфокальной микроскопии готовили криосрезы семенников толщиной 25 мкм, окрашивали их первичными антителами anti-HSV («Abcam», Великобритания), затем – соответствующими вторичными ФИТЦ-конъюгированными антителами («Jackson ImmunoResearch», США); просматривали и фотографировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 STED.

Малолина Е.А., Кулибин А.Ю., Тюленев Ю.А., Кущ А.А.
Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.