Деструктивные изменения в семенниках мыши при ретроградном пути их заражения вирусом простого герпеса

Вирус простого герпеса (ВПГ) вызывает воспалительные заболевания органов мочеполовой системы мужчин, инфицирует мужские половые клетки, его присутствие в эякуляте ассоциируется с бесплодием. Однако сведений о путях проникновения ВПГ в яички, степени повреждения им сперматогенной ткани и влиянии на сперматогенез крайне мало. Целью настоящей работы было изучить действие ВПГ на сперматогенез мыши при ретроградном пути заражения вирусом. Использовали молекулярные (ПЦР в реальном времени), вирусологические, морфологические и иммуногистохимические методы. Анализ показал, что вирусный белок обнаруживается во всех слоях сперматогенного эпителия после введения вируса непосредственно в семенные канальцы. Доля канальцев, содержащих белок ВПГ, на 3-и сутки инфекции составляла 4,9%, достигала максимума на 6-е сутки – 23,5 и 18% для высокой и низкой доз ВПГ соответственно и далее снижалась; на 21-е и 45-е сутки вирусный белок не выявлялся. ДНК ВПГ обнаружена в семенниках на всех сроках инфекции. Начиная с 14-х суток после заражения масса семенников значительно снижалась по сравнению с контролем: к 45-м суткам – в 7,9 раза при высокой дозе ВПГ и в 4,9 – при низкой. Результатом действия ВПГ было развитие орхита и значительных деструктивных изменений в сперматогенной ткани. Доля морфологически нормальных канальцев снижалась до 6 и 15% на 14-е сутки и продолжала оставаться на низком уровне вплоть до 45-х суток. Приблизительно в половине семенных канальцев (46,5%) на 14-е и 21-е сутки отсутствовали соматические клетки Сертоли, необходимые для восстановления сперматогенной ткани. Полученные данные свидетельствуют о том, что при ретроградном пути заражения ВПГ мужских гонад происходят нарушения структуры семенника, гибель половых и соматических клеток, что указывает на необратимость дегенеративных изменений в инфицированных семенниках.

Введение. Установлено, что инфекционные заболевания мужских половых органов могут приводить к бесплодию [1]. В то же время данных о влиянии на мужскую фертильность вируса простого герпеса 1-го и 2-го типов (ВПГ-1, -2), одного из самых распространенных вирусов в человеческой популяции, недостаточно.

ВПГ обнаружен в эякуляте человека, однако частота его выявления варьирует от 2,1 до 49,5% [2–4]. Неоднозначны также данные о влиянии ВПГ на качество спермы и фертильность [3–6]. Противоречия в результатах исследований, скорее всего, обусловлены различиями выборок пациентов и разной чувствительностью применяемых методов детекции вируса.

Показано, что ВПГ не способен проникать в сперматозоиды и инфицировать их [7], однако ДНК и белки ВПГ, а также вирусные капсиды обнаружены непосредственно в сперматозоидах человека [8, 9]. Это дает основание предполагать, что ВПГ заражает половые клетки на более ранних этапах дифференцировки. В инфицированных ВПГ эякулятах часто увеличено число дегенеративных незрелых половых клеток [10–12], что косвенно свидетельствует о нарушении нормального развития мужских половых клеток – сперматогенеза. В то же время о путях проникновения ВПГ в яички, степени нарушения сперматогенеза, развитии инфекционного процесса в мужских половых клетках известно крайне мало.

Целью настоящей работы было оценить влияние ВПГ на сперматогенез мыши после инокуляции ВПГ непосредственно в семенные канальцы, что имитирует один из вероятных путей проникновения вируса в яички у человека – ретроградный – через семявыносящие протоки к сети семенника rete testis и далее в семенные канальцы.

Материалы и методы. В работе использовали 2-месячных самцов мышей линии C57Bl/6. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

Инфицирование семенников мышей проводили ВПГ-1 (штамм F), полученным от проф. Л. Перейра (США). Пассирование и титрование ВПГ осуществляли на перевиваемой культуре клеток Vero. При разработке модели ретроградного введения ВПГ в семенные канальцы использовали методику введения жидкости в семенные канальцы через сеть семенника [13]. В каждый семенник вводили по 15 мкл вируссодержащей жидкости.

Животные были разделены на две группы. Мышам первой группы в каждый семенник инъецировали ВПГ с инфекционной множественностью 104 бляшкообразующих единиц (БОЕ) (высокая доза), мышам 2-й группы – 102 БОЕ (низкая доза). Мышам контрольной группы в семенники инъецировали культуральную среду в том же объеме. Отбор материала проводили на 3-и, 6, 10, 14, 21 и 45-е сутки после инфицирования ВПГ. В каждой группе на каждую экспериментальную точку отбирали материал от 3–5 животных.

Иммуногистохимический анализ. Для выявления белка ВПГ в реакции иммунофлюоресценции (РИФ) готовили криосрезы семенников толщиной 4 мкм и окрашивали их первичными моноклональными антителами (МКА) к позднему белку ВПГ gB, а затем – соответствующими вторичными ФИТЦконъюгированными антителами («Dako», Дания). Срезы просматривали и фотографировали на микроскопе Leica DMRXA2 (США). На трех криосрезах семенников подсчитывали количество семенных канальцев, окрашенных МКА, и выражали в процентах от общего числа канальцев. Для проведения конфокальной микроскопии готовили криосрезы семенников толщиной 25 мкм, окрашивали их первичными антителами anti-HSV («Abcam», Великобритания), затем – соответствующими вторичными ФИТЦ-конъюгированными антителами («Jackson ImmunoResearch», США); просматривали и фотографировали на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 STED.

Малолина Е.А., Кулибин А.Ю., Тюленев Ю.А., Кущ А.А.