Экспериментальная разработка и обоснование протокола децеллюляризации почки с последующей комплексной оценкой качества биологического каркаса

Хроническая почечная недостаточность (ХПН) – одна из самых актуальных проблем современной медицины. Существуют различные методы лечения ХПН, такие как программный и перитонеальный диализы и трансплантация почки. Последний является наиболее перспективным при конечной стадии заболевания. Однако нехватка донорских органов, сложность их доставки, трудность поиска иммунологически совместимых органов и пожизненное назначение иммуносупрессивной терапии способствовали развитию современной тканевой инженерии, приоритетным направлением которой оказалась разработка биоинженерных каркасов с последующим заселением их аутологичными клетками. Применение таких конструкций позволило бы решать как этические, так и иммунологические проблемы трансплантологии.
Целью данного экспериментального исследования стала разработка нового метода децеллюляризации почки на модели мелких лабораторных животных.
Материалы и методы: изучена морфологическая структура полученного бесклеточного матрикса, проведена количественная оценка остатков ДНК в полученном каркасе, предложен новый биофизический метод оценки качества получаемых матриксов методом ЭПР-спектроскопии, а также проведены эксперименты по рецеллюляризации каркаса мезенхимальными мультипотентными стволовыми клетками для оценки цитотоксичности, сохранения клеточной жизнеспособности и метаболической активности.
Результаты: показано, что полученный децеллюляризированный матрикс почки сохраняет архитектонику нативной ткани при полном удалении клеточного материала, не обладает цитотоксическими свойствами, поддерживает адгезию и пролиферацию клеток.
Заключение: все вышесказанное позволяет рассматривать разработанный протокол децеллюляризации как перспективный способ получения тканеинженерных конструкций почки с возможностью клинического применения в обозримом будущем.

Актуальность. Возрастающий уровень летальности и полиэтиологичность патологии делают лечение хронической почечной недостаточности (ХПН) одной из самых актуальных проблем современной медицины. Несмотря на то что трансплантация почки имеет более чем полувековую историю и на протяжении этого периода был накоплен колоссальный опыт, касающийся модернизации хирургической техники, консервации органов, совершенствования и оптимизации протоколов иммуносупрессии, а также послеоперационного ведения пациентов, «листы ожидания» на выполнение оперативного вмешательства во всем мире неуклонно увеличиваются [1, 2]. Ключевой проблемой современной трансплантологии являются прогрессирующий дефицит донорских органов, сложность их доставки, трудность поиска иммунологически совместимых органов и пожизненное назначение иммуносупрессивной терапии [3–5]. Наличие вышеописанных трудностей требует решения, позволяющего устранять как этические, так и иммунологические проблемы трансплантологии, что способствовало развитию современной тканевой инженерии почки, приоритетным направлением которой является разработка биоинженерных каркасов с последующим заселением их аутологичными клетками различных линий. На сегодняшний день в мире существует несколько лабораторий, занимающихся созданием тканеинженерных конструкций (ТИК) почки.

Так, E. Ross и соавт. [6] разработали несколько протоколов децеллюляризации почек крысы детергент-энзиматическим методом путем перфузии через почечную артерию комбинаций различных концентраций Triton X-100 (0,5; 3; 6 и 10 %) с 4%-ным дезоксихолатом натрия, а также 4%-ным SDS. Оба предложенных протокола позволили эффективно удалить клеточный материал, почки приобрели прозрачность при сохранении характерной архитектоники базальной мембраны. C. Liu и соавт. [7] получили бесклеточный матрикс почки крысы путем ретроградной перфузии почечных артерий растворами 1% SDS и 1% TritonX-100. Особенностью указанного протокола помимо изменения концентраций детергентов стало изменение скорости перфузии и общего времени воздействия децеллюляризирующих растворов до 64 ч.

Отсутствие клеток на каркасе верифицировали рутинными гистологическими методами и анализом ультраструктурной архитектоники матрикса. P. Baptista и соавт. [8] разработали перфузионную систему для создания естественных 3D-каркасов с интактной сосудистой сетью не только для почки, но и для других паренхиматозных органов, например печени и поджелудочной железы. Сосуды нативной почки канюлировали, для перфузии использовали растворы TritonX-100 и гидроокись аммония в деионизированной воде. В результате проведенной децеллюляризации получен каркас почки с сохранной сосудистой сетью; окрашивание гематоксилином и эозином, а также иммуногистохимическое окрашивание на содержание коллагена, ламинина и фибронектина подтвердили сохранность архитектоники нативного органа и содержание белков внеклеточного матрикса (ВКМ).

J. J. Song и соавт. [9] децеллюляризировали почку крысы путем введения через почечную артерию 1%-ного раствора SDS под контролем перфузионного давления. В результате эксперимента был получен ацеллюлярный матрикс, сохраняющий архитектонику нативной ткани и белки ВКМ. Указанный каркас заселяли эпителиальными и эндотелиальными клетками сначала статически, а затем перфузионно в биореакторе. После культивирования в условиях in vitro указанная конструкция была ортотопически пересажена крысе. По данным авторов, ТИК успешно функционировала без признаков кровотечения или тромбозов сосудистой сети трансплантата. Однако указанная конструкция все же имела ряд недостатков. Так, уровень гломерулярной фильтрации был ниже, чем в нативных почках, также снижалась фракционная реабсорбция электролитов, что свидетельствовало о функциональной незрелости тканеинженерной почки [9].

Таким образом, неспособность природных материалов полностью воспроизводить сложную структуру ВКМ привела к необходимости использовать децеллюляризированные каркасы нативных органов, полученных от доноров, либо матриксы, изготовленные из полимерных материалов и полностью воспроизводящие структуру нативного органа. Каркасы, полученные путем децеллюляризации, имеют большую биосовместимость и вызывают меньшую, чем синтетические полимеры, реакцию со стороны иммунной системы.

Применение объемных 3D-каркасов позволяет эффективно рецеллюляризировать матрикс различными типами клеток, а следовательно, получать почечную ткань, способную выполнять свои физиологические функции [10]. Однако даже функционирующие в условиях in vitro и in vivo каркасы не лишены недостатков, что оставляет пути для разработки более эффективных и одновременно щадящих способов децеллюляризации. Длительность протоколов, агрессивные детергенты, стремление получить бесклеточный матрикс, иногда в ущерб сохранности компонентов ВКМ, делают поиск оптимальных протоколов с комплексной оценкой качества каркасов весьма актуальным.

Целью исследования стала разработка нового протокола получения децеллюляризированного матрикса почк...

П.В. Глыбочко, С.Н. Алексеенко, Е.А. Губарева, Е.В. Куевда, А.А. Басов, А.С. Сотниченко, С.С. Джимак, И.С. Гуменюк, И.Х. Егиев, В.Н. Чечелян, Р.З. Накохов, О.М. Лясота, Ю.В. Тетерин