Фенотипические и молекулярно-генетические свойства клинических штаммов Escherichia coli, выделенных от пациентов с урологическими заболеваниями

Цель данной работы: охарактеризовать микробиологический и молекулярно-генетический
профили резистентности штаммов E. coli.
Материалы и методы. Штаммы E. coli (n=18) были выделены в рамках пилотного одноцентрового исследования из мочи женщин в возрасте 23–84 лет, проходивших лечение в урологическом отделении в декабре 2016 – январе 2017 г. Оценивали подвижность бактерий, колициногенность, чувствительность к антагонистическому действию лактобактерий, способность к образованию биопленок и чувствительность к антимикробным препаратам. Определяли наличие генов, кодирующих факторы антибиотикорезистентности штаммов.
Результаты. Штаммы E. coli были гетерогенны по подвижности в полужидком агаре, колициногенности и по биопленкообразованию. Они были чувствительными к антагонистическому действию Lactobacillus acidophilus, нитрофурантоину, меропенему, фосфомицину и основным функциональным классам дезинфектантов и антисептиков, применяемым в лечебных учреждениях, но устойчивыми к β-лактамам, фторхинолонам и аминогликозидам. У двух штаммов идентифицирован ген устойчивости к колистину mcr-1.
Заключение. Анализ выявленных в клинических штаммах E. coli генетических детерминант антибиотикорезистентности свидетельствует о генетическом разнообразии изученных штаммов. Полученные данные по чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам и дезинфектантам могут быть использованы клиницистами при выборе оптимальной антибиотикотерапии и схемы обработки абиотических поверхностей в урологических отделениях.

Введение. Инфекции мочевыводящих путей (ИМП), пиелонефриты, циститы и уретриты, относятся к числу широко распространенных бактериальных инфекций человека [1]. Они существенно снижают качество жизни пациента и трудно поддаются лечению. Эти инфекции особенно актуальны для женщин: по статистике, около половины женского населения имели хотя бы один эпизод урологической инфекции в течение жизни [1]. Возникновение неосложненных ИМП чаще всего связано с восходящей инфекцией энтеропатогенов, преодолевающих естественный защитный барьер мочеполовой системы, который в основном обеспечивается нормофлорой, в первую очередь лактобациллами влагалища [2–4]. Уменьшение количества лактобацилл в нормофлоре человека служит фактором риска развития ИМП [5]. Лечение неосложненной ИМП проще других инфекций, поскольку в подавляющем большинстве случаев можно установить возбудителя, причем чаще всего заболевание вызвано моноинфекцией; при осложненной ИМП очень часто имеются причины, поддерживающие инфекционный процесс: обструкция, конкременты и др. [1].

К основным возбудителям ИМП относятся уропатогенные Escherichia coli (УПЕК), которые характеризуются высокой генетической и фенотипической гетерогенностью [6]. Кроме того, они способны образовывать биопленки, обеспечивающие их защиту от иммунной системы макроорганизма и антимикробных препаратов [7].

Цель данной работы: охарактеризовать микробиологический и молекулярно-генетический профили резистентности штаммов E. coli.

Материалы и методы

Биоэтические требования

Материалы, использованные в данном исследовании, не содержат персональных данных пациентов: в описании клинических изолятов отсутствуют фамилии и имена пациентов, их адреса и номера историй болезней. В то же время в соответствии с требованиями Биоэтического комитета Российской Федерации каждый пациент подписывал информированное согласие при поступлении в лечебное учреждение на проведение лабораторных исследований.

Штаммы

Штаммы E. coli (n=18) были выделены в рамках пилотного одноцентрового исследования из мочи женщин в возрасте 23–84 лет, проходивших лечение в урологическом отделении Инфекционной клинической больницы № 1 Ярославля в декабре 2016 – январе 2017 г. Для видовой идентификации бактерий осуществляли посевы на дифференциально-диагностические питательные среды Агар Эндо-ГРМ, агар Клиглера-ГРМ, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной и ацетатный агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) согласно инструкции производителя с последующим подтверждением видовой принадлежности бактерий на приборе MALDI-TOF Biotyper («Bruker», Германия).

Питательные среды, условия культивирования и хранения

Культуры штаммов E. coli выращивали на плотной питательной среде ГРМ 1 и жидкой питательной среде ГРМБ (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, Россия) в аэробных условиях при температуре 37°C. Хранили культуры при при температуре -70°C в 20%-ном растворе глицерина.

Оценка подвижности бактерий

Подвижность E. coli определяли по методике [8] с изменениями. Готовили бактериальную взвесь (108 КОЕ/мл) в среде ГРМБ, культивировали 4 ч при температуре 37°С с аэрацией (100 об/мин), разводили физиологическим раствором (ФР) в 1000 раз, 10 мкл наносили в центр чашки Петри с 0,3%-ным агаром на основе ГРМБ, культивировали 24 ч при температуре 37°С, не переворачивая чашки Петри. Подвижность бактерий оценивали, измеряя диаметр зоны распространения бактерий в толще полужидкого агара в мм. Эксперимент проводили трижды. В качестве отрицательного контроля использовали штамм E. coli С600, полученный из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Определение колициногенности

Продукцию колицинов клетками E. coli выявляли методом двухслойного агара [9]. Наличие колициногенности у штамма определяли как наличие зоны задержки роста тест-штамма шириной 2 мм и более. В качестве тест-штамма, чувствительного к колицинам, также использовали штамм E. coli С600.

Определение чувствительности к антагонистическому действию лактобактерий

Для этого использовали штамм Lactobacillus acidophilus, выделенный из пробиотического препарата Лактобактерин (НПО «Биомед», Россия), рекомендованного в качестве интравагинального применения. Антагонистическую активность штамма исследовали методом агаровых слоев. Штамм считали чувствительным к антагонистическому действию лактобактерий при наличии зоны задержки роста шириной 1 мм и более [4].

Биопленкообразование

Способность штаммов к образованию биопленок оценивали по методике [10] с изменениями: 30 мл жидкой питательной среды ГРМБ инокулировали одной полной бактериологической петлей (1 мкл) ночной агаровой культуры, вносили в среду 3 полипропиленовых купона (3 см2), инкубировали при температуре 37°С с аэрацией 150 об/мин на шейкере Unimax 1010 («Heidolph Instruments», Германия) в течение 24 ч. После этого купоны дважды отмывали в ФР и обрабатывали ультразвуком на гомогенизаторе Soniprep 150 («MSE Ltd», Великобритания) при амплитуде 2×10-6 м в ...

П.В. Слукин, Э.А. Светоч, Е.М. Асланян, Е.И. Асташкин, М.Г. Ершова, Е.Д. Полетаева, А.П. Шепелин, Н.К. Фурсова