Ген FMR1: новые возможности оценки овариального резерва

Цель исследования. Выявление представленности разного числа СGG-повторов у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ) и их связи с уровнем антимюллерова гормона (АМГ). Материал и методы. На первом этапе работы пациентки были распределены на 3 группы (А, В и С) в зависимости от числа CGG-повторов в аллелях (аллель 1 с меньшим числом повторов, 2 – с большим). На втором этапе – на 3 группы в зависимости от выявленной зиготности в гене FMR1. В 1-ю группу вошли женщины, у которых оба аллеля в нормальном диапазоне повторов, т.е. 26–34 повторов, 2-я группа была представлена гетерозиготными носителями аномального числа повторов, т.е. одна аллель в пределах нормального диапазона, а вторая, выходящая за эти пределы. 3-я группа состояла из женщин, имеющих оба аллеля вне зоны нормального диапазона CGG-повторов (26>CGG>34). Определяли статистическую связь числа повторов и параметров овариального резерва. Результаты исследования. У больных с ПНЯ практически с одинаковой частотой встречаются как нормальные, так и аномальные длины CGG-повторов в гене FMR1 (45 против 55%). В группе с нормальным числом повторов (группа В) было выявлено статистически значимое повышение уровня АМГ (0,49±1,13 пг/мл) в сравнении с группами с коротким (группа А) (0,1±0,14 пг/мл) и длинным (группа С) числом повторов (0,09±0,15 пг/мл), p<0,05. Для больных с резко сниженным овариальным резервом более характерно укорочение длин CGG-повторов, нежели их удлинение (34 против 11%), что несколько отличается от привычной точки зрения, представленной в литературе. Ранее большинство авторов указывали на диагностическую значимость удлинения СGG-повторов в пределах серой (41—50) и премутационной зоны (51—200). При проведении сравнительного анализа выявлена прямая умеренная корреляционная зависимость между числом CGG-повторов в гене FMR1 и уровнем АМГ в группе А (r=0,358, p<0,05). В то же время в группе С обнаружена обратная умеренная зависимость между числом повторов и уровнем АМГ (r=-0,3174, p<0,05). В группе с нормальным числом повторов не выявлено какой-либо зависимости между уровнем АМГ и возрастом пациенток. В группах с гомозиготным и гетерозиготным носительством аномальных длин СGG-повторов выявлена умеренная обратно пропорциональная зависимость между уровнем АМГ и возрастом. Заключение. Длина CGG-повторов в гене FMR1 безусловно может быть одним из ранних объективных предикторов, указывающих на риск развития ПНЯ, и служить новым тестом для прогнозирования функциональной активности яичников.

Решающие успехи молекулярной биологии за последние несколько лет в расшифровке тонкой структурно-функциональной организации генома человека, картировании на хромосомах многих структурных генов привели к значительному прогрессу в области медицинской генетики, существенно расширили и обогатили наши знания о молекулярной природе наследственных заболеваний, способах их точной диагностики и профилактики. Одним из наиболее ярких событий в молекулярной генетике за минувшее десятилетие явилось открытие принципиально нового типа мутаций — экспансии (увеличения) числа копий внутригенных тринуклеотидных повторов, приводящей к появлению наследственных заболеваний человека. Такой класс мутаций, связанный с нестабильностью данных повторов, называют динамическими мутациями.

Y.H. Fu и соавт. в 1991 г. выявили, что для каждой третьей женщины характерен числовой диапазон в пределах 29–30 CGG-повторов в гене FMR1, который он предложил считать условной нормой [11]. В дальнейшем в работах L.S. Chen [7] и N. Gleicher и соавт. [14, 17] было показано, что для фертильных женщин с нормальным овариальным резервом характерно именно это количество повторов.

Welt и соавт. в 2004 г. cообщили, что у больных с увеличением длины CGG-повторов в гене FMR1, вплоть до премутации гена (50–200 CGG-повторов), отмечается статистически значимое повышение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), снижение уровней ингибина А и В, не соответствующих их возрастной норме. Таким образом, ими было предложено использовать аномальную длину CGG-повторов в качестве прогностического критерия развития преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ), что было подтверждено временем наступления менопаузы, на 5 лет опережающим возраст их сверстниц — носительниц условной нормы CGG- повторов в гене FMR1 [26].

Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности изучения представленности разного числа СGG-повторов у пациенток с ПНЯ и их связи с уровнем антимюллерова гормона (АМГ), что и явилось целью настоящего исследования.

Материал и методы исследования

Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы 100 пациенток с ПНЯ оценивали по результатам определения уровня гипофизарных (лютеинизирующий гормон — ЛГ, ФСГ) и яичниковых (эстрадиол) гормонов. Для оценки овариального резерва у 72 из них определяли уровень АМГ в плазме крови. Концентрацию гормонов исследовали методом иммуноферментного или радиоиммунного анализа с помощью соответствующих тест-систем на автоматическом анализаторе Cobar Core II. Для определения аллелей CGG-повтора в гене FMR1 использовали метод метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР) на генетическом анализаторе АВI3100 в соответствии с протоколом фирмы Applied Biosystems. Результаты представляли в виде графического изображения сигналов маркера и исследуемых фрагментов гена FMR1 и таблицы с параметрами пиков и длинами фрагментов ДНК.

В зависимости от числа CGG-повторов в алле-лях (аллель 1 с меньшим числом повторов, 2 — с большим) пациентки были разделены на 3 группы: группа А (аллель 1<26 триплетных повторов) включала женщин с патологически коротким числом CGG-триплетов. Группа В (аллель 1≥26 и аллель 2 ≤34) представляла лиц с нормальным числом повторов [11]. Группа С (аллель 2>34) состояла из женщин с длинным числом триплетных CGG-повторов, которые, согласно данным литературы, должны ассоциироваться с повышенным риском развития преждевременного старения яичников [6–8].

Для оценки возможной статистической связи между коротким (<26) в аллели 1 и длинным числом повторов в аллели 2 (>34) и параметрами овариальной функции (ФСГ и АМГ) были построены модели линейной регрессии для групп А и С.

Вторым этапом работы было разделение этих же больных на 3 группы в зависимости от выявленной зиготности гена FMR1. В 1-ю группу вошли пациентки, у которых число CGG-повторов в гене FMR1 было в пределах нормальных значений а обеих аллелях (26-34), 2-я группа была представлена гетерозиготными носителями аномального числа повторов, т.е. одна аллель в пределах нормального диапазона, а вторая, выходящая за эти пределы, 3-я группа состояла из женщин, имеющих оба аллеля вне зоны нормального диапазона CGG-повторов (26>CGG>34).

Статистический анализ полученных данных выполнен на компьютере PC IBM (США) с помощью электронных таблиц Microsoft Excel, пакета прикладных программ Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc. (США), пакета SPSS (версия 10.0.7). Результаты исследования представлены как среднее±стандартное отклонение (M±SD). С помощью W-теста Шапиро–Уилка показатели были проверены на нормальное распределение.

Определение достоверности различий между сравниваемыми группами осуществлялось с помощью двухвыборочного t-теста с различными дисперсиями, метода Колмогорова–Смирнова, Манна–Уитни, а также определения критерия Стьюдента для оценки разности выборочных долей. Порядковые данные были оценены на основе метода χ² или точного критерия Фишера. Различия ...

Шамилова Н.Н., Марченко Л.А.