Генетические факторы риска акушерских осложнений при самопроизвольной беременности и беременности после вспомогательных репродуктивных технологий

01.05.2012
1044

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России, Москва

Цель исследования. Изучить роль генных полиморфизмов, ассоциированных с формированием системы мать-плацента-плод, в развитии акушерских осложнений после вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материал и методы. В исследуемую группу вошли 167 беременных после применения ВРТ (средний возраст 34,4±4,3 года). Контрольную группу составили 145 женщин с самопроизвольной одноплодной беременностью (средний возраст 29,9±4,7 лет). Изучался полиморфизм генов цитокинов, участвующих в процессах имплантации и плацентации (IL-10, IL-6, IL-6R), регулирующих формирование сосудистой сети плаценты (VEGFA), генов, контролирующих метаболические функции плаценты (PPARG, IGF II), а также полиморфизм генов системы свертывания крови (F2, F5, FGB, ITGA2, ITGB3, SERPINE1) и ферментов фолатного цикла (MTHFR, MTR, MTRR).
Результаты исследования. Полиморфизмы генов (IL-10 -592 А/С, VEGFA -2578 A>C, SERPINE1 -675 5G>4G, IL6 -174 C>G, VEGFA -634 G>C, PPARG C>G [Pro12Ala]) ассоциированы с развитием акушерских осложнений независимо от способа достижения беременности, что отражает их вовлеченность в различные звенья патогенеза.

Ежегодно почти у 600 тыс. россиянок выявляются репродуктивные расстройства, восстановление которых, в соответствии с Концепцией демографической политики государства на период до 2025 г., предполагает среди прочих методов использование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Однако применение ВРТ представляет не только новые возможности, но и новые проблемы, что в России связано с отсутствием традиций их практического использования, несмотря на то что многие страны уже накопили почти тридцатилетний опыт (в мире рождены более 4 млн детей с использованием этой технологии). Так, до настоящего времени не сформулированы основные принципы ведения беременности после ВРТ, что связано с отсутствием фундаментальных исследований в этой области.

В настоящее время установлено, что нарушение формирования системы мать-плацента-плод на ранних этапах развития является фактором, во многом определяющим развитие осложнений во время беременности, а в тяжелых случаях предопределяющих материнскую и перинатальную заболеваемость и смертность [1].

С позиций предиктивной медицины пристальное внимание исследователей обращено на генетические особенности системы мать-плацента-плод. Генный полиморфизм факторов, формирующих фетоплацентарную систему, в ряде случаев определяет особенности функционирования этой системы, детерминирует ее реакции на различные воздействия. Наибольший интерес представляют однонуклеотидные генные полиморфизмы (SNP), широко распространенные в популяции и в ряде случаев приводящие к изменению активности гена или модификации белкового продукта. При определенных условиях такие изменения могут приводить к развитию патологических процессов. Выявление соответствующих генных полиморфизмов позволяет выделить группу риска по развитию акушерских осложнений после ВРТ.

Цель исследования: изучить роль генных полиморфизмов, ассоциированных с формированием системы
мать-плацента-плод, в развитии акушерских осложнений у пациенток после ВРТ.

Материал и методы исследования

В исследуемую группу (I группа – индуцированная беременность – ИБ) вошли 167 беременных после применения ВРТ (средний возраст 34,4±4,3 года). Контрольную группу (II группа – самопроизвольная беременность – СБ) составили 145 женщин с самопроизвольной одноплодной беременностью (средний возраст 29,9±4,7 года). Число пациенток, необходимое для исследования, было рассчитано с помощью программы Epi Info версия 6.

В группе ИБ у 69 (41,3%) пациенток беременность была достигнута с помощью традиционного
экстракорпорального оплодотворения, у 57 (34,1%) – с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, а у 41 (24.6%) – после переноса криоконсервированных эмбрионов.

Длительность бесплодного периода в основной группе не превышала 5 лет у 37 (22,1 %), 10 лет – у 81 (48,5%) пациенток, более 10 лет – у 49 (29,4%) пациенток. У 69 (41%) пациенток, беременность наступила с 1-й попытки ВРТ, у 67 (38,9%) пациенток – в анамнезе 1–2 попытки, у 21 (12,5%) пациентки – 3–4 попытки и у 10 (7,6%) пациенток – более 5 попыток. У 109 (65%) пациенток стимуляцию суперовуляции проводили по длинному протоколу и у 46 (35%) – по короткому с антагонистами. Число полученных ооцитов в среднем составило 13,5±5,9, число перенесенных эмбрионов в полость матки – 1,7±0,5.

В большинстве наблюдений бесплодие было вторичным, так, у 41% женщин в анамнезе отмечено до 3 беременностей. Причинами бесплодия являлись: трубно-перитонеальный фактор – 27%, эндометриоз – 21%, синдром поликистозных яичников – 15%, мужской фактор – 23%, бесплодие неясного генеза – 14%.

Из исследования исключали пациенток с многоплодной беременностью, одноплодной беременностью в результате редукции одного эмбриона из двойни, с тяжелой формой экстрагенитальной патологии, с наличием хромосомных аномалий у плода.

В ходе наблюдения за течением беременности пациенткам проводили полный спектр клинико-лабораторного и инструментального обследований.

Гены-кандидаты для анализа отбирались на основе их вклада в формирование фето-материнского комплекса. К ним относятся гены, контролирующие ответную реакцию иммунной системы в процессах имплантации и плацентации (IL-10, IL-6, IL-6R), регулирующие формирование сосудистой сети плаценты (VEGFA), метаболические функции плаценты (PPARG, IGF II) (табл. 1).

Таблица.1 Изучаемые полиморфизмы генов.

Выделение ДНК проводили следующим образом: 0,5 мл крови, взятой на EDTA в качестве антикоагулянта, смешивали в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках типа Эппендорф с 0,5 мл лизирующего раствора, состоящего из 0,32 М сахарозы, 10 мМ Трис-HCl рН=7,5, 5 мМ MgCl, 1% Тритона Х-100, центрифугировали в течении 1 мин. при 10 000 об/мин, супернатант удаляли, а осадки клеточных ядер два раза отмывали указанным буфером. Последующий протеолиз проводили в 50 мкл буферного раствора, содержащего 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl рН=8,3, 2,5 мМ MgCl, 0,45% NP40, 045% Твина 20 и 250 мкг/мл протеиназы К при 37 °С в течение 20 мин. Инактивировали протеиназу К при 98 °С в течение 20 мин. Полученные образцы ДНК до типирования хранили при -20 °С. Концентрация ДНК, определенная на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США), составляла в среднем 50–100 мкг/мл.

Исследование генного полиморфизма проводили с использованием метода аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим гидролизом ампликонов соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой. Геномную ДНК из образцов крови выделяли по стандартной методике с использованием протеиназы К, фенол-хлороформной экстракции и осаждения этанолом. Постановку ПЦР проводили в реакционной смеси, содержащей: 5 мкл 10хПЦР-буфера (670 мМ трис-HCl, pH=8,8, 67 mM Mg сульфата аммония, 100 мМ меркаптоэтанола, 10 мкл DMSO, по 12 мМ каждого дНТФ, 10 нг геномной ДНК, 2 единицы Taq-полимеразы и 50 рмоль соответствующей пары праймеров). Идентификацию аллельных вариантов проводили по наличию сайта узнавания для соответствующей рестриктирующей эндонуклеазы с помощью электрофореза в агарозном геле.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ «Statistica for Windows 5.0». Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий χ² Пирсона. Различия считали статистически значимыми при р

Результаты исследования

Cтруктура акушерских осложнений в исследуемой и основной группах представлена следующим образом. В I триместре беременности кровотечения имели место у 21,6% беременных после ВРТ и 14,3% – при CБ (p=0,033); ранние репродуктивные потери (самопроизвольные выкидыши) – у 14,4% и 8,9% соответственно (p=0,041). Во II и III триместрах отмечены: синдром задержки развития плода – у 14,4% женщин в группе ИБ и 10,1% – в контрольной группе (p=0,025); поздние выкидыши – у 7,5 и 4,2% соответственно (p=0.043); преэклампсия – у 11,7 и 6,5% соответственно (p=0,012); преждевременные роды – у 16,6 и 10,1% соответственно (p=0,037).

Таблица 2. Распределение аллелей и гаплотипов изучаемых генов в исследуемой и контрольной группах.

Таким образом, отмечено статистически значимое увеличение частоты акушерских осложнений на протяжении всей беременности в группе женщин, забеременевших после применения ВРТ. В то же время не выявлено статистически значимых различий в распределении аллелей/гаплотипов всех изучаемых генов, ответственных за формирование системы мать-плацента-плод между группой ИБ и СБ (табл. 2) Однако при оценке ассоциации аллелей/генотипов с акушерскими осложнениями установлены статистически значимые различия (табл. 3 и 4).

Таблица 3. Полиморфизмы генов, ассоциированные с акушерскими осложнениями.

Таблица 4. Статистически значимые ассоциации аллелей и генотипов с акушерскими осложнениями в исследуемых группах.

Обсуждение

При носительстве аллеля А полиморфного участка С-592A гена IL-10 в гомозиготном состоянии у пациенток обеих групп увеличивался риск ранних репродуктивных потерь (3,2 и 3,0 соответственно) и поздних выкидышей (1,4 и 1,8 соответственно). Предположительно аллель А усиливает продукцию IL-10 мононуклеарами, что характерно для женщин с привычным невынашиванием беременности. Кроме того, избыточная продукция IL-10 приводит к дисбалансу в иммунной системе, что в свою очередь нарушает экспрессию молекул 1-го и 2-го классов главного комплекса гистосовместимости, при этом в избыточном количестве синтезируются большие гранулоциты и моноциты, что приводит к потере беременности. [11].

Установлено, что IL-6 является важным медиатором в ответе организма на инфекционный агент.
Представленная работа демонстрирует, что гомозиготный генотип GG (замена цитозина на гуанин)
приводит к снижению промоторной активности и в результате к снижению синтеза IL-6, что ассоциировано с риском преждевременных родов как при ИБ, так и при СБ (2,5 и 2,1 соответственно) Полученные результаты согласуются с данными литературы [10].

IL-6 осуществляет свои функции опосредованно через соответствующие рецепторы (IL-6R). Согласно
данным литературы, уровень растворимого IL-6R в амниотической жидкости при преждевременных
родах повышен [8]. D.R. Velez и соавт. [21] обнаружили, что концентрация растворимого рецептора IL-6 в амниотической жидкости строго ассоциирована с гаплотипом IL-6R беременных и плодов, что свидетельствовало о возможности использования системы IL-6/IL-6R в качестве предиктора преждевременных родов. В нашем исследовании не выявлено ассоциации аллелей/генотипов IL-6R A>C (Asp358Ala) с акушерскими осложнениями ни при ИБ, ни при СБ. Система мать-плацента-плод также контролируется генами сосудисто-эндотелиального фактора роста А (VEGFA). VEGFA экспрессируется на материнской и плодовой поверхностях плаценты с ранних сроков беременности, что указывает на его исключительную роль в ангиогенезе трофобласта, дифференциации цитотрофобласта и дальнейшем формировании плаценты. Изменение активации генов VEGFA приводит к нарушениям формирования системы мать-плацента-плод, что в дальнейшем приводит к невынашиванию беременности [7]. Показано, что минорный аллель А промоторной области VEGFA -2578A ассоциирован со снижением экспрессии VEGFA; в отличие от этого полиморфизм -634 G>C увеличивает продукцию VEGFA. В нарушении плацентации играет роль как усиление, так и снижение экспрессии VEGFA. Полученные результаты подтверждаются работами различных авторов. Так, Р. Carmeliet и соавт. установили, что снижение экспрессии VEGFA приводит к гибели эмбрионов [4], в то время как Schneider и соавт. провели исследование, показавшее, что избыточная экспрессия VEGFA также приводит
к невынашиванию беременности [18]. Результаты данного исследования показали, что аллель С полиморфизма гена -2578 A>C ассоциирован с невынашиванием беременности, что согласуется с исследованием D. Papazoglou и соавт. [16]. Кроме того, мы оценивали ассоциацию аллелей/генотипов гена 634 G>C и установили, что носительство С аллеля ассоциировано с ранними репродуктивными потерями в обеих группах (ОШ=1,1 и 1,4, pT. У пациенток, носительниц Т аллеля, отмечается снижение уровня VEGFA, что предрасполагает к развитию преэклампсии [3, 19].

При оценке ассоциации аллелей/генотипов +936 C>T с акушерскими осложнениями не выявлено статистически значимых различий ни при ИБ, ни при СБ, что отличается от результатов, полученных J.Y. Shim и соавт. [19], которые продемонстрировали ассоциацию между полиморфизмом гена +936 C>T и преэклампсией в корейской популяции.

Основной функцией фетоплацентарного комплекса является участие в газовом обмене, метаболизме, поддержании гомеостаза в межворсинчатом пространстве. Уникальностью PPARγ является то, что
он участвует во всех этих процессах [12]. Наиболее изученным полиморфизмом гена PPARG является
полиморфизм C>G (Pro12Ala), при котором происходит замена нуклеотида C на G в 34-м положении экзона B, что приводит к замещению пролина на аланин в аминокислотном положении 12 изоформы PPARγ2 и ассоциировано со снижением активности PPARγ2 [12]. Согласно нашему исследованию, носительство аллеля Ala12 полиморфизма гена PPARG C>G (Pro12Ala) ассоциировано с рождением маловесных детей как при ИБ, так и при СБ (ОШ=2,5 и 2,7; р

Рост и развитие плода находятся по контролем гормонов и факторов роста, важнейшим из которых является семейство инсулиноподобных факторов роста (IGF-I и IGF-II), участвующих в ауто- и паракринной стимуляции пролиферации клеток и их дифференцировки [5, 17]. В опытах на мышах было показано, что их выключение приводит к развитию синдрома Беквита-Видемана [20] или Сильвера-Рассела [9]. В представленном исследовании при оценке ассоциации аллелей/генотипов IGF-II C13790G с акушерскими осложнениями не выявлено статистически значимых различий в обеих группах.

В последние годы в литературе представлено огромное число исследований, посвященных изучению взаимосвязи полиморфизмов генов, регулирующих фолатный обмен, и риска акушерских осложнений. Установлено, что одним из пусковых механизмов является повышение уровня гомоцистеина, что в свою очередь приводит к эндотелиальной клеточной дисфункции и оксидативному стрессу. В нашем исследовании не выявлено ассоциации между акушерскими осложнениями и носительством аллелей полиморфизмов генов-регуляторов ферментов фолатного цикла (677 C>T, 1298 A>C, 2756 A>G, 2756 A>G (Asp919Gly, 66 A>G [Ile22Met]), что можно объяснить высоким потреблением витаминов, содержащих фолаты в исследуемых группах беременных [13, 14].

Среди генетических маркеров предрасположенности к тромбофилии выделяют полиморфизм гена
ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) [15]. Чрезмерно высокий уровень PAI-1 в эндометрии связывают со снижением глубины инвазии трофобласта и нарушением имплантации [2]. Установлено, что полиморфизм -675 5G/4G гена SERPINE1 связан с делецией в промоторном участке гена и изменяет экспрессию PAI-1. В нашем исследовании мы получили достоверную связь между гетерозиготным гаплотипом -675 5G/4G PAI-1 и кровянистыми выделениями в I триместре беременности в обеих группах. При оценке ассоциаций аллелей/генотипов остальных полиморфизмов, связанных с риском нарушения системы свертывания крови и акушерских осложнений, не выявлено статистически значимых различий ни при ИБ, ни при СБ.

Таким образом, представленная работа подтверждает наличие ассоциаций ряда генных полиморфизмов с акушерскими осложнениями. При этом ни в одном случае не обнаружено статистически значимого влияния способа достижения беременности на силу или направленность ассоциации генетических маркеров с акушерскими осложнениями. Полученные результаты свидетельствуют, что при самопроизвольной или индуцированной беременности действуют одинаковые факторы риска.

Список литературы

1. Стрижаков А.Н. и др. Роль ангиогенных факторов роста в прогнозировании плацентарной недостаточности // Вопр. гин., акуш. и перинатол. – 2009. – Т. 8, № 4. – С. 5–11.
2. Anteby Y., Greenfield C., Natanson-Yaron S. Vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor and fibroblast growth factor-4 and -10 stimulate trophoblast plasminogen activator system and metalloproteinase-9 // Mol. Hum. Reprod. – 2004. – Vol. 10. – P. 229–223.
3. Banyasz I., Szabo S., Bokodi G. et al. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in severe pre-eclampsia // Mol. Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 12. – P. 233–236.
4. Carmeliet P., Ferreira V., Breier G. et al. Abnormal blood vessel development and lethality in embryos lacking a single VEGFA allele // Nature. – 1996. – Vol. 380. – P. 435–439.
5. Constancia M., Hemberger M., Hughes J. et al. Placental-specific IGF2 is a major modulator of placental and fetal growth. // Nature. – 2002. – Vol. 417. – P. 945–948.
6. Coulam C.B., Jeyendran R.S. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and recurrent pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. – 2008. – Vol. 59. – P. 301–305.
7. Ferrara N., Carver-Moore K., Chen H. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGFA gene // Nature. – 1996. – Vol. 380. – P. 439–442.
8. Ghezzi F., Cohen J., Tolosa J.E. et al. Microbial invasion of the amniotic cavity is associated with increased concentrations of amniotic fluid interleukin-6 soluble receptor // Am. J. Obstet. Gynecol. – 1996. – Vol. 174. – P. 402.
9. Giquel C., Rossignol S., Cabrol S. et al. Epimutation of the telomeric imprinting center region on chromosome 11p15 in Silver-Russell syndrome // Nat. Genet. – 2005. – Vol. 37. – P. 1003–1007.
10. Hartel C., Finas D., Ahrens P. et al. Interleukin 6 -174 G/C promoter polymorphism and pregnancy complications: Results of a prospective cohort study in 1626 pregnant women // Am. J. Reprod. Immunol. – 2008. – Vol. 59, N 4. – P. 347–351.
11. Kimatrai M., Blanco O., Munoz-Fernandez R. et al. Contractile activity of human decidual stromal cells. II. Effect of interleukin-10 // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2005. – Vol. 90. – P. 6126–6130.
12. Meirhaeghe A., Boreham C.A.G., Murray L.J. et al. A possible role for the PPARG Pro12Ala polymorphism in preterm birth // Diabetes. – 2007. – Vol. 56. – P. 494–498.
13. Miyaki K., Murata M., Kikuchi H. et al. Assessment of tailor-made prevention of atherosclerosis with folic acid supplementation: randomized, double-blind, placebo-controlled trials in each MTHFR C677T genotype // J. Hum. Genet. – 2005. – Vol. 50, N 5. – P. 241–248.
14. Murtaugh M.A., Curtin K., Sweeney C. et al. Dietary intake of folate and co-factors in folate metabolism, MTHFR polymorphisms, and reduced rectal cancer // Cancer Causes Control. – 2007. – Vol. 18, N 2. – P. 153–163.
15. Nordengren J., Pilka R., Noskova V. et al. Differential localization and expression of urokinase plasminogen activator(uPA), its receptor(uPAR), and its inhibitor (PAI-1) mRNA and protein in endometrial tissue during the menstrual cycle // Mol. Hum. Reprod. – 2004. – Vol. 10. – P. 655–663.
16. Papazoglou D., Galazios G., Papatheodorou K. et al. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and idiopathic recurrent pregnancy loss // Fertil. and Steril. – 2005. – Vol. 83. – P. 959–963.
17. Randhawa R., Cohen P. The role of the insulin-like growth factor system in prenatal growth // Mol. Genet. Metab. – 2005. – Vol. 86. – P. 84–90.
18. Schneider B.P., Radovich M., Sledge G.W. et al. Association of polymorphisms of angiogenesis genes with breast cancer // Breast Cancer Res. Treat. – 2008. – Vol. 111. – P. 157–163.
19. Shim J.Y., Jun J.K., Jung B.K. et al. Vascular endothelial growth factor gene +936 C/T polymorphism is associated with preeclampsia in Korean women // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2007. – Vol. 197. – P. 271; e 1–4.
20. Sparago A., Cerrato F., Vernucci M. et al. Microdeletions in the human H19 DMR result in loss of IGF2 imprinting and Beckwith-Wiedemann syndrome // Nat. Genet. – 2004. – Vol. 36. – P. 958–996.
21. Velez D.R., Menon R., Thorsen P. et al. Ethnic differences in interleukin 6 (IL-6) and IL6 receptor genes in spontaneous preterm birth and effects on amniotic fluid protein levels // Ann. Hum. Genet. – 2007. – Vol. 71. – P. 586–600.

Об авторах / Для корреспонденции

Александрова Наталья Владимировна, канд. мед. наук докторант ФГБУ НЦ АГиП им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России
Адрес:117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Телефон: 8 (495) 438-25-38
E-mail: N_aleksandrova@oparina4.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь