Генотипирование эмбрионов с помощью фрагментного STR-анализа после проведения полногеномной амплификации

Цель. Разработать метод определения материнского или отцовского происхождения хромосомных анеуплоидий эмбриона с помощью STR-анализа у пациентов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материалы и методы. Разработка велась с использованием материала биопсии трофэктодермы эмбрионов 58 пар пациентов (116 человек). Предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) и моногенные заболевания (ПГТ-М) осуществляли с помощью высокопроизводительного секвенирования. Определение происхождения анеуплоидий проводили фрагментным анализом STR-маркеров.
Результаты. После ПГТ-А анеуплоидии были выявлены у 67 эмбрионов (41%); эуплоидными были 65 (40%); мозаичные формы были обнаружены у 28 (17%) эмбрионов. Были разработаны праймеры для анализа хромосом 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 19, 22 и X. Проведенный анализ (16-я хромосома (n=7 эмбрионов), 19-я хромосома (n=5 эмбрионов) и 22-я хромосома (n=8 эмбрионов)) показал, что с помощью данного подхода можно идентифицировать анеуплоидии как материнского, так и отцовского происхождения.
Заключение. Показана принципиальная технологическая возможность проведения фрагментного STR-анализа с целью генотипирования эмбрионов с использованием различных продуктов полногеномной амплификации. Это позволяет проводить ПГТ-А и ПГТ-М совместно с генотипированием эмбрионов без необходимости повторных биопсий. Изучение влияния родительского вклада в развитие анеуплоидий эмбрионов в будущем позволит выбрать оптимальную тактику ведения пациентов с неоднократными неудачными попытками ВРТ и невынашиванием беременности в анамнезе.

Ключевым этапом каждого цикла экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является отбор эмбриона с наивысшим потенциалом имплантации [1]. Тем не менее перенос в полость матки эмбриона с хорошей морфологией не всегда приводит к его имплантации [2], поскольку одним из факторов имплантационных и ранних репродуктивных потерь являются хромосомные анеуплоидии (ХА) эмбрионов [3]. Кроме того, описаны анеуплоидии, приводящие к остановке развития эмбриона и нарушению клеточного деления [3]. В настоящее время морфологические методы оценки качества эмбриона не позволяют с достаточно высокой точностью выявить анеуплоидии [4]. Установлено, что с увеличением возраста матери растет вероятность обнаружения хромосомных аномалий эмбрионов [5], однако даже при оплодотворении донорских яйцеклеток, полученных у молодых здоровых женщин, в 18–61% случаев обнаруживаются ХА эмбрионов [6].

Большинство анеуплоидий имеют материнское происхождение, т.е. возникают вследствие мейотических ошибок [7]. Ранее было показано, что в бластомерах хромосомные трисомии материнского происхождения выявлялись почти в 10 раз чаще, чем трисомии отцовского происхождения. Предимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А) с помощью анализа полярных телец показало, что ошибки в мейозе II (MII) встречаются чаще, чем в мейозе I (МI). Ошибки материнского мейоза являются основными причинами формирования ХА эмбрионов человека; из них в 45% случаев ХА формируется за счет MII, а 34% ХА эмбрионов – за счет MI [8].

В течение последних лет значительно повысилась доля пациенток старшего репродуктивного возраста, обращающихся по поводу лечения бесплодия при помощи вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [9], при этом обнаружение ХА у них может достигать 90% случаев. В связи с этим прилагается много усилий для внедрения новых подходов с целью диагностики ХА. К технологиям, позволяющим оценивать все 24 хромосомы, относят сравнительную геномную гибридизацию [10], количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [11, 12] и высокопроизводительное секвенирование [13–15]. Недостатком вышеуказанных методов является невозможность различить материнское или отцовское происхождение анеуплоидий. Происхождение анеуплоидии можно определить с помощью детекции и сравнительного анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в образцах ДНК эмбрионов и их родителей [7]. Генотипирование обоих родителей и эмбриона в то же время позволяет нам различать родительское происхождение каждой хромосомы, а также идентифицировать позиции, в которых произошел кроссинговер. Более того, с помощью SNP-гаплотипирования возможно измерение числа хромосом. Все это дает возможность получать исчерпывающую информацию о механизмах появления и происхождении ХА у эмбрионов. Однако данный метод является очень дорогим и требует специального оборудования.

Цель исследования: разработать метод определения материнского или отцовского происхождения ХА эмбриона с помощью STR-анализа у пациентов программ ВРТ.

Материалы и методы

Для разработки данного метода использовали материал биопсии трофэктодермы эмбрионов 58 пар пациентов (116 человек), обратившихся для проведения программы ВРТ с ПГТ-А по следующим показаниям: возраст матери старше 35 лет, неоднократные неудачные поп...

Екимов А.Н., Александрова Н.В., Шубина Е.С., Ритчер О.В., Гольцов А.Ю., Назаренко Т.А.